現(xiàn)代生物科技基因工程專(zhuān)題

現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題

專(zhuān)題復(fù)習(xí)§1:基因工程（1）基因工程的誕生Ⅰ（2）基因工程的原理及技術(shù)Ⅰ（3）基因工程的應(yīng)用Ⅰ第一章（1）基因工程的誕生P1：基因工程的核心？－－構(gòu)建重組DNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）基因工程誕生的基礎(chǔ)DNA是遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立中心法則（1）基因工程的誕生P1：基因工程的核心？－－構(gòu)建重組DNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）①限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）②DNA連接酶③載體（運(yùn)載體）三大工具工具酶僅指限制酶和DNA連接酶，不包含載體。工具與工具酶的區(qū)別基因工程的技術(shù)保障限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）1、作用特點(diǎn)：①特定的序列＋特定的位點(diǎn)②對(duì)外不對(duì)內(nèi)2、作用的本質(zhì)：在特定位點(diǎn)水解磷酸二酯鍵，把DNA分子切成片段3、效果：形成黏性末端或平末端限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？…GAATTC……CTTAAG…反向?qū)ΨQ重復(fù)排列(回文結(jié)構(gòu))EcolI↑↓什么叫黏性末端？當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)切開(kāi)時(shí)，被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。特點(diǎn)：?jiǎn)捂溚钩鯣//CTTAAAATTC//G什么叫平末端？

當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。特點(diǎn)：沒(méi)有單鏈凸出CCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSmaⅠ分析限制酶的切割作用的一般方法先將告知的單鏈變雙鏈，明確識(shí)別序列及其堿基對(duì)數(shù)，然后根據(jù)切點(diǎn)畫(huà)出黏性末端，對(duì)不同限制酶的末端進(jìn)行比較作出答案。下面是5種限制酶對(duì)DNA分子的識(shí)別序列和剪切位點(diǎn)圖（箭頭表示剪切點(diǎn)、切出的斷面為黏性末端）。限制酶1：—↓GATC—

限制酶2：—CATG↓—限制酶3：—G↓GATCC—

限制酶4：—CCGC↓GG—限制酶5：—↓CCAGG—下例敘述正確的是（）A．限制酶2和4識(shí)別的序列都包含4個(gè)堿基對(duì)B．限制酶3和5識(shí)別的序列都包含5個(gè)堿基對(duì)C．限制酶1和2切出的黏性末端相同D．限制酶1和3切出的黏性末端相同為了解基因結(jié)構(gòu)，通常選取一特定長(zhǎng)度的線性DNA分子，先用一種限制酶切割，通過(guò)電泳技術(shù)將單酶水解片段分離，計(jì)算相對(duì)大??；然后再用另一種酶對(duì)單酶水解片段進(jìn)行降解，分析片段大小。下表是某小組進(jìn)行的相關(guān)實(shí)驗(yàn)：(1)由實(shí)驗(yàn)可知，在這段已知序列上，A酶與B酶的識(shí)別序列分別為_(kāi)____個(gè)和_______個(gè)。已知一線性DNA序列共有5000bp（bp為堿基對(duì)）第一步水解產(chǎn)物（單位bp）第二步水解產(chǎn)物（單位bp）A酶切2100將第一步水解產(chǎn)物分離后，分別用B酶切割1900200140080060010001000500500B酶切2500將第一步水解產(chǎn)物分離后，分別用A酶切割1900600130080050012001000200經(jīng)A、B酶同時(shí)切19001000800600500200(2)根據(jù)表中數(shù)據(jù)，請(qǐng)?jiān)谙聢D中標(biāo)出相應(yīng)限制性酶的酶切位點(diǎn)并注明相關(guān)片段的大小。已知一線性DNA序列共有5000bp（bp為堿基對(duì)）第一步水解產(chǎn)物（單位bp）第二步水解產(chǎn)物（單位bp）A酶切2100將第一步水解產(chǎn)物分離后，分別用B酶切割1900200140080060010001000500500B酶切2500將第一步水解產(chǎn)物分離后，分別用A酶切割1900600130080050012001000200經(jīng)A、B酶同時(shí)切1900100080060050020050080060019002001000B酶B酶A酶A酶A酶(3)已知BamHI與BglⅡ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)如圖所示，用這兩種酶和DNA連接酶對(duì)一段含有數(shù)個(gè)BamHI和BglU識(shí)別序列的DNA分子進(jìn)行：反復(fù)的切割、連接操作，若干循環(huán)后和_______序列明顯增多。－A－TCTAGGATCT－A－－G－CCTAGGATCC－G－G

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GGC

TT

AA

AA

TT

C

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

GEcolⅠ切割DNA連接酶在脫氧核糖與磷酸基之間形成

磷酸二酯鍵DNA連接酶DNA連接酶DNA聚合酶對(duì)象不同本質(zhì)相同結(jié)果不同DNA連接酶分為兩類(lèi)：①?gòu)拇竽c桿菌中分離得到：EcolⅠDNA連接酶，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接。②從T4噬菌體中分離到：

T4連接酶，既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低。

DNA連接酶與DNA聚合酶的比較將與模板鏈堿基互補(bǔ)配對(duì)的脫氧核苷酸連接起來(lái)形成子鏈將兩個(gè)DNA分子連接起來(lái)形成重組DNA分子載體能將外源基因送入受體細(xì)胞的工具就是載體。種類(lèi)：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)、植物病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)的核心是構(gòu)建重組DNA分子重組DNA分子＝基因表達(dá)載體，一個(gè)基因表達(dá)載體必須具有目的基因外，還應(yīng)該有啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。為什么不能將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞完成轉(zhuǎn)化呢？載體種類(lèi)：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。作為載體的必要條件受體細(xì)胞最常用的載體－－質(zhì)粒質(zhì)粒――細(xì)胞染色體（或擬核DNA分子）外能自主復(fù)制的小型環(huán)狀DNA分子；質(zhì)粒應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：①在宿主細(xì)胞內(nèi)能自主復(fù)制，具有復(fù)制原點(diǎn)，可以使插入的目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制；②有多個(gè)限制酶酶切點(diǎn)，且切點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)內(nèi)；③具備易于檢測(cè)的標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因。但天然質(zhì)粒往往不能滿足上述要求，因此需要根據(jù)不同目的和需要，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行人工改造，現(xiàn)在所使用的質(zhì)粒幾乎都是經(jīng)過(guò)改造的。（2）基因工程的的原理及技術(shù)原理變異類(lèi)型：廣義上的基因重組實(shí)現(xiàn)性狀定向改造：目的基因在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定和高效地表達(dá)。即復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯操作步驟①獲得目的基因②形成重組DNA分子③將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞④篩選含有目的基因的受體細(xì)胞⑤目的基因表達(dá)（2）基因工程的的原理及技術(shù)①獲得目的基因（2）基因工程的的原理及技術(shù)方法1：從基因文庫(kù)中篩選目的基因（需應(yīng)用限制酶）方法2：人工合成目的基因反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法①多數(shù)目的基因的獲得方法②真核細(xì)胞基因到原核細(xì)胞中表達(dá)擴(kuò)增目的基因PCR技術(shù)①獲得目的基因②形成重組DNA分子（2）基因工程的的原理及技術(shù)具有相同的物質(zhì)和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[以脫氧核苷酸為單位的雙螺旋結(jié)構(gòu)]重組的基礎(chǔ)：相同的限制酶與雙酶切形成的重組DNA分子上：既有目的基因又有標(biāo)記基因同一種限制酶→相同限制酶（P6）目的基因AATTCGCTTAAG目的基因AATTCGCTTAAG目的基因AATTCGCCTAGG目的基因AATTCGCCTAGG僅用限制酶EcoRI（G↓AATTC）切割：限制酶EcoRI（G↓AATTC）和BamHI（G↓GATCC）聯(lián)合切割：GCTTAAGATCCG質(zhì)粒目的基因AATTCGCCTAGG某一DNA分子片段可被限制性內(nèi)切酶BbuI切成三段（切點(diǎn)為—CGTAC↓G—），中間一段被限制性內(nèi)切酶NotI切成兩段（切點(diǎn)為—GCCGG↓C—）。（1）在下面寫(xiě)出被兩種限制性內(nèi)切酶所切的一段DNA分子的兩個(gè)黏性末端。該DNA片段能否首尾連接形成環(huán)？

，為什么？

。（2）上述的兩種限制性內(nèi)切酶作用的化學(xué)鍵是否相同？為什么？（3）如上述的DNA片段中含有某目的基因，現(xiàn)要實(shí)現(xiàn)目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合，需要哪些酶？—CGTAC↓G—…—GCCGG↓C

—…—CGTAC↓G－—G↑CATGC—…—C↑GGCCG—…—G↑CATGC－CATG-C//G

兩個(gè)黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)限制性內(nèi)切酶作用于兩個(gè)核苷酸間的磷酸二酯鍵不能相同限制性內(nèi)切酶BbuI＋DNA連接酶

G—…

—GCCGGCATGC—…

—C+NotIC//G-CCGG①獲得目的基因②形成重組DNA分子③將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（2）基因工程的的原理及技術(shù)常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。常用方法？顯微注射技術(shù)Ca2+處理誘導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法增加細(xì)菌細(xì)胞壁還是細(xì)胞膜的通透性？先導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌的目的？①獲得目的基因②形成重組DNA分子③將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（2）基因工程的的原理及技術(shù)常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。常用方法？顯微注射技術(shù)Ca2+處理誘導(dǎo)法農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在導(dǎo)入重組DNA分子時(shí)，不是所有的細(xì)胞都接納了重組DNA分子！①獲得目的基因②形成重組DNA分子③將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞④篩選含有目的基因的受體細(xì)胞（2）基因工程的的原理及技術(shù)分子水平：DNA分子雜交法（技術(shù)）核心－－DNA探針目的基因的脫氧核苷酸（單鏈）序列片段用熒光分子或放射性同位素標(biāo)記看能否形成雜合的雙鏈區(qū)①獲得目的基因②形成重組DNA分子③將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞④篩選含有目的基因的受體細(xì)胞（2）基因工程的的原理及技術(shù)分子水平：DNA分子雜交技術(shù)標(biāo)記基因篩選法利用抗性基因選擇性培養(yǎng)基Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因圖a示基因工程中經(jīng)常選用的載體——pBR322質(zhì)粒，Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因。目的基因如果插入四環(huán)素抗性基因中，將使該基因失活，而不再具有相應(yīng)的抗性。abAmprTetrc再將滅菌絨布按到圖b的培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布平移按到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖c的結(jié)果（空圈表示與b對(duì)照無(wú)菌落的位置）。

為了檢查載體是否導(dǎo)入原本沒(méi)有Ampr和Tetr的大腸桿菌，將大腸桿菌培養(yǎng)在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，得到如圖b的結(jié)果（黑點(diǎn)表示菌落）。①獲得目的基因②形成重組DNA分子③將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞④篩選含有目的基因的受體細(xì)胞⑤目的基因表達(dá)（2）基因工程的的原理及技術(shù)Ⅰ：利用核酸（DNA-RNA）分子雜交法看是否生成了相應(yīng)mRNAⅡ：用抗原－抗體發(fā)生特異性結(jié)合看是否合成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)Ⅲ：從個(gè)體水平看是否表現(xiàn)出特定的性狀，如用棉花葉喂蟲(chóng)，看蟲(chóng)食用后是否死亡判斷抗蟲(chóng)基因在棉花植株上的表達(dá)。插入哪一條染色體、插入某一染色體的位置都是隨機(jī)的，這樣可能破壞正?；虻慕Y(jié)構(gòu)和功能，使受體細(xì)胞不能完成某項(xiàng)生命活動(dòng)甚至死亡。目的基因插入動(dòng)植物細(xì)胞基因組的隨機(jī)性問(wèn)題糖蛋白是蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)上加工完成的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這種細(xì)胞器，因此，由大腸桿菌中生產(chǎn)糖蛋白是不可能的?；蚬こ讨猩a(chǎn)糖蛋白，為什么不選