2A 前處理參考資料

近代化學(xué)分離技術(shù)（2） －樣品前處理 －色譜技術(shù)發(fā)展歷史簡介王程思考題（1）基因測序：生物大分子的分離-----電泳凝膠電泳-----生化中最重要的分離技術(shù)“人類基因計劃”，實質(zhì)上是“人類基因的化學(xué)測序計劃”。這一計劃雖是生物學(xué)家提出來的，卻是分析化學(xué)家完成的。

Capillaryelectrophoresis(CE)

毛細(xì)管電泳-----繼承GC的毛細(xì)管柱和凝膠電泳技術(shù)毛細(xì)管電泳-----在基因組研究中的決定性作用AdenineGuanineCytosineThymineLehningerStrategyforautomatedDNAsequencingEachdideoxynucleotideusedintheSangermethodcanbelikedtoafluorescentmoleculethatgivesallfragmentsterminatinginthatnucleotideaparticularcolor.AllfourlabeledddNTPsareaddedtoasingletube.TheresultingcoloredDNAfragmentsarethenseparatedbycapillarygelelectrophoresiswhichallowsfasterseparationthanordinarygelelectrophoresis.Allfragmentsofagivenlengthmigratetothesamepositiononthegel.Thecolorassociatedwitheachbandisdetectedusingalaserbeamandacomputer-associateddetectionsystem.Acomputerprogramdeterminesthesequence.ThisisthesequencingmethodthatwasusedintheHumanGenomeProject.1990年人類基因組計劃原定15年時間完成，開始急功近利，大量經(jīng)費用于基因圖譜，測序技術(shù)成為“瓶頸”1993年重新制定計劃，每年拿一半經(jīng)費（1億美元）開發(fā)測序新技術(shù)，由最原始的板凝膠電泳－陣列毛細(xì)管電泳，全基因組鳥槍測序技術(shù)，使得計劃提前到2001年完成。DNA鑒別身份比指紋更可靠，100億分之一誤差。轉(zhuǎn)基因食品（豆油）人類基因組Proteome（4個堿基，3－4萬個基因）人類蛋白質(zhì)組genome（20個氨基酸，30萬種蛋白）拍相片與拍電影。全自動的測序儀器：MegaBace蛋白質(zhì)組研究中心課程思考題（2）藥物分析：藥物上市流通要質(zhì)量控制，確保藥品安全、有效，國家標(biāo)準(zhǔn)以藥典頒布薄層層析和分光光度計-----液相色譜(UV)CE相對不穩(wěn)定，定量困難，做為互補(bǔ)。片劑，針劑相對簡單，但是研究藥物在體內(nèi)的代謝、藥代動力學(xué)、不同臟器的藥物分布、血藥濃度。質(zhì)譜具備結(jié)構(gòu)鑒定能力，就是一種有效手段了。環(huán)保和制藥已知結(jié)構(gòu)化合物EpimedinA淫羊霍甙AC39H50O20分子量:838.80葡萄糖OOOCH3OOHOOOOHOOHOHHOOOHOHOHOHOHOH鼠李糖葡萄糖未知結(jié)構(gòu)化合物C33H40O16分子量:692.23693.2385.2547.2123450.51.01.56x106x105-鼠李糖-146-葡萄糖-162母核質(zhì)量數(shù)相差：385.2–369.1=16(O)23.4min葡萄糖OOOCH3OOHOOOHOHOOHOHOHOHOH鼠李糖OHOOOCH3OHOHHO母核質(zhì)量數(shù)：369.1分析儀器的選擇GC/FPD-適合有機(jī)磷和有機(jī)硫農(nóng)殘化合物GC/ECD-適合有機(jī)氯農(nóng)殘化合物GC/NPD-適合有機(jī)氮和有機(jī)磷化合物GC/MSD

通用分析方法，結(jié)合NIST98標(biāo)準(zhǔn)譜庫和農(nóng)藥譜庫可進(jìn)行農(nóng)殘化合物鑒定HPLC-柱后衍生用熒光檢測適合氨基甲酸鹽類化合物L(fēng)C/MS-高靈敏度,高選擇性的檢測方法鰻魚，查160種物質(zhì)有無超標(biāo)。課程思考題（3）興奮劑檢測：1976年開始使用GC-MS檢測類固醇，60年代就有商品化儀器。先抽血,比賽前打進(jìn)去肽類生長激素，促紅細(xì)胞生成素生物技術(shù)，基因興奮劑同位素比質(zhì)譜（C元素）解決內(nèi)源性類固醇，（4）水處理分離技術(shù)污水處理－沉降，深度水處理－膜分離

高效液相色譜(HPLC)液質(zhì)聯(lián)用LC/MS毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜CE/MS氣質(zhì)聯(lián)用GC/MS氣相色譜(6890GC)電感偶合等離子質(zhì)譜(ICP/MS)（5）儀器進(jìn)展：為什么質(zhì)譜那么貴？合資，但沒有消化成功。國內(nèi)有制造能力才會降價，如：手機(jī)從分析化學(xué)的發(fā)展的四個階段，看分離技術(shù)的重要性：1：定性鑒別：砒霜?中草藥鑒別味道?真金經(jīng)過火燒后無煙灰色氧化層?試金石（含二氧化硅），灰黑色鵝卵石型，黃銅礦CuFeS2－墨綠色，黃鐵礦FeS2－黑色，金－黃色。2：定量分析：滴定分析，儀器分析。生物和環(huán)境中復(fù)雜樣品體系，污染測試系統(tǒng)，影響儀器性能需經(jīng)預(yù)處理后分析，否則結(jié)果不可靠3：復(fù)雜樣品已知物的分離分析，保留時間定性。色譜/電泳4：未知物的分離及分子結(jié)構(gòu)解析，波譜定性。地溝油？在首飾質(zhì)量監(jiān)督部門日常檢驗中以無損檢測法為主，密度法，結(jié)合X熒光光譜法，電子探針等大型儀器24K-100%;18K-75%;12K-50%;

不經(jīng)過分離的定性分析（鑒別）是危險的分離是樣品分析前處理的重要內(nèi)容對應(yīng)上述4個階段以色譜為代表的分離分析技術(shù)成為前沿領(lǐng)域色譜檢測器由追求高靈敏度向具備結(jié)構(gòu)鑒定能力發(fā)展準(zhǔn)確度，靈敏度，選擇性Thebranchofchemistrythatdealwiththeseparation,identificationanddetermination（成分分離，定性表征，含量測定）ofcomponentsinasample.Italsotraditionallyinducescoverageofchemicalequilibriumandstatisticaltreatmentofdata.評價分析方法，儀器的好壞的尺度化學(xué)發(fā)光，電分析，毛細(xì)管電泳價格便宜，可自行組裝，有潛在的應(yīng)用價值方法學(xué)基礎(chǔ)研究?遠(yuǎn)水解不了近渴？基因療法治療癌癥？分析化學(xué)依靠溶液化學(xué)反應(yīng)的日子一去不復(fù)返，計算機(jī)，激光，納米，芯片，光纖，仿生，微電子，生物技術(shù)。合成新化合物-研制儀器工欲善其事，必先利其器。在美國，疾病診斷70％是靠分析化驗，30％靠醫(yī)生經(jīng)驗?；仡櫤脱a(bǔ)充樣品采集，處理，測試，數(shù)據(jù)處理，報告結(jié)果。儀器先進(jìn)，分離和檢測在整個分析時間上所占比例越來越少，樣品前處理成為勞動強(qiáng)度最大的環(huán)節(jié)。（1）基體組成復(fù)雜，干擾組分量相對較大的條件下——分離。除去對分析系統(tǒng)有害的物質(zhì)。（2）測不到？待測組分的含量較低，現(xiàn)有方法的靈敏度不夠高——富集或分離富集。大多數(shù)樣品是多相非均一性的，大氣飄塵、氣溶膠、微生物、砂礫、生物體。911，廢墟中尸體殘骸。如強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，細(xì)菌，氣泡不能直接上色譜。衍生化（糖沒有吸收，基因測序用熒光標(biāo)記），富集（本質(zhì)是分離），可提高103－105倍，如共沉淀富集，溶出伏安分析，固相萃取富集。為啥要前處理？儀器和設(shè)備分析儀器：HPLC（泵，自動進(jìn)樣器/手動進(jìn)樣器,柱溫箱，DAD檢測器，化學(xué)工作站。前處理設(shè)備：渦流混勻器，超聲波發(fā)生器，離心機(jī)，離心管（15ml），高速臺式離心機(jī)，氣流加熱快速濃縮裝置，微量可調(diào)移液器，尖嘴吸液管。測定步驟樣品的提取及凈化稱取2.00g均勻試樣，放入15ml離心管內(nèi)加入0.5ml10％硫酸鈉水溶液和4.0ml乙腈－氯仿(10:1)混合溶劑。在渦流混勻器上劇烈混合成勻漿。豬肉中的十種磺胺殘留用乙腈－氯仿混合溶劑提取，用UV-D檢測，外標(biāo)法定量。離心3min(3500r/min)上清液用尖嘴吸液管轉(zhuǎn)入第二只15ml離心管中第二只離心管殘渣1用10：1的乙腈/氯仿混合溶劑繼續(xù)提取離心3min(3500r/min)上清液并入第二只離心管在氣流加熱快速濃縮裝置中，低于40℃蒸發(fā)至干殘渣21ml2％硫酸鈉水溶液和2ml正己烷，在渦流混合器上劇烈混合，使殘渣2溶解。離心3min用尖嘴吸液管移去己烷層，并棄去。再用2ml正己烷洗滌一次，同樣棄去己烷相。第二只離心管中的水相1.加入3ml乙腈/氯仿(1:2)，于渦流混勻器上劇烈混合，離心3min，用尖嘴吸液管將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)入第三只離心管2.加入2ml乙腈/氯仿(1:2)，于渦流混勻器上劇烈混合，離心3min，用尖嘴吸液管將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)入第三只離心管第三只離心管低于40℃，氣流加熱快速濃縮，蒸發(fā)至干殘渣3用流動相溶解殘渣3，并準(zhǔn)確定容1ml。離心(16000r/min)5min上清液供LC測試測定1)色譜條件：色譜柱：250×4.6mm，10umODS柱柱溫：45℃流動相：乙腈/乙酸/水=18:1:81流動相流速：1.10ml/min

檢測波長：285nm

進(jìn)樣量：10ul質(zhì)譜：本身有分離，純度要求不高NMR：高純度（異構(gòu)體辨析）元素分析：高純度（排除水，溶劑殘留）光譜（IR，UV-vis）：分辨率差（溶劑空白）合成產(chǎn)物鑒別－波譜分析而對分離富集的要求主要有以下兩點：（1）干擾組分分離完全下，回收率越接近100%越好（待測的損失?。?；（2）簡便、快速，成本低廉。試劑對人體和生態(tài)環(huán)境的影響小。質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1％0.01％一1％低于0.01％的痕量組份回收率大于99.9％大于99％90％～95％表征分離效率的參數(shù)●回收率●富集倍數(shù)●分辨率●分離系數(shù)●分離效率●峰容量對回收率的要求隨被測組分的含量不同而不同分離的本質(zhì)和具體方法純化學(xué)方法是利用化學(xué)性質(zhì)不同，加入試劑產(chǎn)生發(fā)應(yīng)，把被測組分與基底干擾分開，如沉淀、衍生（顯色）、絡(luò)合（掩蔽劑）等。不涉及化學(xué)發(fā)應(yīng)，利用物理狀態(tài)（相態(tài)）轉(zhuǎn)變，以研究組分在兩相之間分布為基礎(chǔ)的。因此狀態(tài)(相)的變化常常用來達(dá)到分離的目的。色譜上尤其是根據(jù)兩種不互溶溶劑中溶解度的差異（分配系數(shù)不同）物理法離心、過濾、吸附、超聲振蕩、離子交換、柱（紙）層析固、液分子大小、分子量、顆粒度、密度、吸附力、溶解度透析、液液萃取、索氏萃取液、液滲透壓、分配系數(shù)蒸餾、揮發(fā)、氮氣吹掃、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)液、氣蒸汽壓真空升華、冷凍干燥（常溫易失活）固、氣化學(xué)法衍生，沉淀，絡(luò)合有副產(chǎn)物，操作復(fù)雜傳統(tǒng)分離方法缺點：1：反復(fù)操作，強(qiáng)度大2：手工操作，誤差大3：時間長4：無法在線質(zhì)控5：不利環(huán)保優(yōu)點：1：不涉及復(fù)雜設(shè)備和儀器2：不需要長期培訓(xùn)2：揮發(fā)和蒸餾分離法揮發(fā)和半揮發(fā)性混合液，利用汽化溫度不同，簡單蒸餾:相差30度的物質(zhì)，減壓蒸餾:熱不穩(wěn)定和高沸點。分離原理利用物質(zhì)揮發(fā)性（蒸氣壓）的差異。將組分從液體或固體樣品中轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嗟倪^程，它包括蒸發(fā)、蒸餾、升華、氣體發(fā)生和驅(qū)氣。1：沉淀分離法分析化學(xué)中，揮發(fā)法（1）分離基體（2）分離待測痕量組分。氫化物原子吸收：如待測元素As在氫化發(fā)生器中用硼氫化物還原成氣態(tài)金屬化合物，用火焰AAS，電熱原子化（高溫爐法，石墨爐）AAS測定。冷原子熒光測汞儀：汞原子蒸氣壓低，無需原子化器。低壓汞燈發(fā)出253.7nm的激發(fā)光。常用的無機(jī)元素及化合物的揮發(fā)形式單質(zhì)鹵素、I2（升華）鋼鐵或有機(jī)物中C，通氧燃燒（約1100°C），CO2鋼鐵或礦石中S，通氧燃燒（約1300°C），SO2N，NH3（H2SO4+CuSO4+H2O2消化為NH4+）NaOH加熱，銨鹽或有機(jī)物中N的測定或除去NH4+，劣質(zhì)奶粉中蛋白質(zhì)含量低。冷凍干燥（冷凍和升華）降溫使得被干燥樣品固化，真空使得溶劑分子從固化樣品中直接汽化分離。用于生物組織顯微觀察，熱敏化合物或常溫下易失活的生物分子的干燥。3:離子交換分離法：利用離子交換劑與溶液中的離子之間發(fā)生的交換反應(yīng)。屬固—液分離法。特點：適用于帶電荷的離子之間的分離，帶電荷與中性物質(zhì)的分離、制備等。操作：樹脂的選擇、預(yù)處理和裝柱；交換；洗滌；洗脫；樹脂再生離子交換分離法的應(yīng)用1.電解質(zhì)與非電解質(zhì)的分離：牛奶中重金屬離子的分離富集。2.水的凈化——去離子水的制備。復(fù)柱法：陽離子交換柱—陰離子交換柱—混合柱IC是測定水中無機(jī)陰陽離子，含氧酸根離子，堿金屬離子的好方法離子色譜的基本流程圖淋洗液

泵色譜柱檢測器

泵液分離

檢測

記錄F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-進(jìn)樣閥抑制器檢測池進(jìn)樣4:液－液萃取分離法溶劑萃取，用與水不相混溶的有機(jī)溶劑同試液一起震蕩，一些組分進(jìn)入有機(jī)相中，另一些仍在水中，從而分離富集。如被萃取組分有色，則可直接光度測定，稱萃取光度法。液固萃取，固體樣品先粉碎和干燥，萃取時攪拌，加熱回流。超聲萃取，以超聲為能源，產(chǎn)生微泡，膨脹和破裂，空穴作用使得萃取劑分子和樣品表面加快作用。重要的萃取體系1.螯合物（內(nèi)絡(luò)鹽）萃取體系；2.離子締合物萃取體系；3.溶劑化合物萃取體系；4.簡單分子萃取體系萃取分離法設(shè)備簡單，操作快速。費時，工作量較大；溶劑易揮發(fā)、易