第十二章陽(yáng)性桿菌

第十二章

革蘭陽(yáng)性桿菌第一節(jié)炭疽芽胞桿菌

（Bacillusanthracis，B.anthraci)形態(tài)染色:致病菌中最大的G+桿菌兩端平切、竹節(jié)狀有毒株可有明顯莢膜芽胞多在25～30℃有氧條件下形成橢圓形，小于菌體，位于菌體中央在培養(yǎng)基中、土壤內(nèi)、動(dòng)物尸體解剖后暴露在空氣中，都易形成芽胞在活體及未解剖尸體內(nèi)不形成芽胞二、微生物特性培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧最適溫度30～35℃普通培養(yǎng)基扁平、粗糙、不透明、灰白色、無(wú)光澤，邊緣不整齊的菌落低倍鏡下菌落邊緣呈卷發(fā)狀BAP：12～15h不溶血，18～24h輕微溶血其他需氧芽胞桿菌大多溶血明顯而快速肉湯—絮狀沉淀生長(zhǎng)明膠表面液化成漏斗狀，形成倒松樹狀NaHCO3BAP有毒株：產(chǎn)生莢膜，黏液型菌落，呈粘絲狀(鑒別要點(diǎn))無(wú)毒株：粗糙型菌落生化反應(yīng)：分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、蕈糖有些菌能遲緩發(fā)酵甘油和水楊素產(chǎn)酸不產(chǎn)氣水解淀粉、還原硝酸鹽不產(chǎn)生吲哚和硫化氫、不利用檸檬酸鹽、不分解尿素在牛乳中生長(zhǎng)2～4天牛乳凝固→緩慢胨化觸酶（+）、卵磷脂酶弱（+）菌體多糖抗原耐熱、耐腐敗，長(zhǎng)時(shí)間煮沸仍能與特異性抗體發(fā)生環(huán)狀沉淀反應(yīng)（Ascoli熱沉淀反應(yīng)）特異性不高與毒力無(wú)關(guān)是多種植物凝集的受體

莢膜多肽抗原與毒力有關(guān)莢膜腫脹試驗(yàn)有鑒定意義莢膜抗體染色抗原構(gòu)造芽胞抗原有免疫原性和血清學(xué)診斷價(jià)值炭疽毒素外毒素復(fù)合物保護(hù)性抗原（protectiveantigenPA）

致死因子（lethalfactorLF）

水腫因子（edemafactorEF）

單獨(dú)皆無(wú)致病性具有抗吞噬和免疫原性要求快速檢出、分離鑒定病原菌，以利早期確診、查清疫源、及時(shí)治療和采取預(yù)防對(duì)策三、微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本的采集與處理皮膚炭疽：病灶深部標(biāo)本肺炭疽：痰和血液腸炭疽：糞、嘔吐物腦膜炭疽：CSF、血液死亡動(dòng)物：嚴(yán)禁解剖，可消毒皮膚后割取耳朵、舌尖，采集少量血（心血），局限性病灶可取病變組織或附近淋巴結(jié)。無(wú)雜菌污染標(biāo)本：直接接種肉湯增菌或固體培養(yǎng)基污染雜菌固體標(biāo)本：加10倍量生理鹽水充分浸泡，振蕩10～15min、靜置10min，取懸液65℃水浴30min或85℃5min，再增菌和培養(yǎng)污染雜菌液體標(biāo)本：離心，棄上清液后，加0.5%洗滌劑振蕩10～15min，離心取沉淀物增菌和分離培養(yǎng)生化反應(yīng)噬菌體裂解青霉素抑制毒力試驗(yàn)檢驗(yàn)程序皮毛、腐敗臟器等血液Ascoli試驗(yàn)以NS制成懸液經(jīng)加溫或飽和尿素處理肉湯增菌培養(yǎng)BAP或戊烷脒平板2%兔血清肉湯4-8hG染色鏡檢菌落特征動(dòng)力觀察串珠試驗(yàn)確定報(bào)告莢膜腫脹試驗(yàn)涂片染色：G染色、莢膜染色、芽胞染色—初步報(bào)告莢膜熒光抗體染色核酸檢測(cè)：核酸雜交分離培養(yǎng)：BAP、戊烷脒多粘菌素B平板2%兔血清肉湯增菌→分離培養(yǎng)形態(tài)和菌落特征生化試驗(yàn):表12-1串珠試驗(yàn):接種于含青霉素(0.05～0.5U/ml)的肉湯中，37℃6h，高倍鏡下見大而均勻成串的圓球狀菌體類炭疽無(wú)此現(xiàn)象鑒定試驗(yàn)青霉素抑制試驗(yàn)：接種于含青霉素5、10、100U/ml瓊脂平板，37℃24h

生長(zhǎng)受抑制不生長(zhǎng)串珠和青霉素抑制聯(lián)合試驗(yàn)：

噬菌體裂解試驗(yàn)：AP631炭疽噬菌體

NaHCO3毒力試驗(yàn)：接種于含0.5%NaHCO3和10%馬血清的平板，10%CO2、37℃、24～48h黏液型菌落：有毒株粗糙型菌落：無(wú)毒株動(dòng)物試驗(yàn)：小鼠、家兔或豚鼠皮下接種Ascoli熱沉淀試驗(yàn)：可作追溯性診斷第二節(jié)蠟樣芽胞桿菌

(Bacilluscereus,B.cereus)形態(tài)與染色：G+大桿菌生長(zhǎng)6h后即形成圓形芽胞、位于菌體中心或次末端、不突出菌體菌體兩端平截，多數(shù)呈鏈狀排列多有周鞭毛、無(wú)莢膜二、微生物特性培養(yǎng)特性需氧或兼性厭氧營(yíng)養(yǎng)要求不高最適溫度30~35℃普通瓊脂平板：菌落較大，灰白色，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀有蠟樣光澤卵磷脂平板BAP—有β溶血卵黃平板—可分解卵磷脂而形成白色的混濁環(huán)，稱乳光反應(yīng)或卵黃反應(yīng)生化反應(yīng)能分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、水楊素、糊精，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣能胨化牛乳，液化明膠，VP（+）、卵磷脂酶（+）多次傳代后生化特性?？筛淖?nèi)?、微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本采集：可疑食物、糞便、嘔吐物檢驗(yàn)程序嘔吐物、殘留食物等活菌計(jì)數(shù)接種普通瓊脂平板、BAP、卵黃平板37℃18-24h純培養(yǎng)動(dòng)物試驗(yàn)（腸毒素測(cè)定）生化反應(yīng)血清凝集（分型）報(bào)告結(jié)果直接涂片染色鏡檢檢驗(yàn)方法直接鏡檢分離培養(yǎng)與活菌計(jì)數(shù)普通瓊脂平板、BAP、卵黃平板鑒定與分型：根據(jù)菌落特點(diǎn)、形態(tài)染色、生化反應(yīng)等初步鑒定生化分型、血清分型、噬菌體分型，腸毒素檢測(cè)第三節(jié)肉毒梭菌

（Clostridiumbotulinum,C．botulinum

）革蘭陽(yáng)性粗大桿菌，兩端鈍圓，單個(gè)或成雙排列，有時(shí)可見短鏈狀，無(wú)莢膜。

20℃～25℃時(shí)形成橢圓形芽胞，粗于菌體，位于次極端，呈湯匙狀或網(wǎng)球拍狀厭氧培養(yǎng)生化反應(yīng)隨毒素型不同有所差異

主要生物學(xué)特性微生物學(xué)檢查法標(biāo)本及處理食物中毒患者：食物嬰兒肉毒病患者：糞便食品衛(wèi)生檢樣樣品：發(fā)酵制品（豆瓣醬、臭豆腐等）糞便、食物等標(biāo)本可先80℃加熱10min，再厭氧培養(yǎng)毒素檢查毒素檢查（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)）毒素檢出試驗(yàn)待測(cè)物精處理，腹腔注射小白鼠，約經(jīng)數(shù)小時(shí)的潛伏期，出現(xiàn)肉毒中毒的典型癥狀，注射后數(shù)小時(shí)即可發(fā)病，24h內(nèi)死亡，觀察4d~7d。毒素確認(rèn)試驗(yàn)直接注射試驗(yàn)組

煮沸15min對(duì)照組多價(jià)血清處理對(duì)照組毒素定型試驗(yàn)用A~G各單型及混合抗毒素分別處理樣品，分別注射小白鼠，觀察96h。

鑒定依據(jù)形態(tài)染色厭氧，能消化肉渣且變黑，產(chǎn)生惡臭味菌落邊緣有皺褶毒素分型防治原則加強(qiáng)食品衛(wèi)生管理和監(jiān)督提高防范意識(shí)（低溫保存食物，高溫破壞毒素）盡早診斷，迅速注射A、B、E三型多價(jià)抗毒素第四節(jié)白喉棒狀桿菌

(C.diphtheriae)

共同特征G+桿菌、一端或兩端膨大成棒狀染色不均勻，兩端濃染或有異染顆粒無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞排列不規(guī)則，呈柵欄狀白喉棒狀桿菌——致病菌類白喉棒狀桿菌——條件致病菌二、生物學(xué)特性形態(tài)與染色:G+細(xì)長(zhǎng)微彎的桿菌一端或兩端膨大呈棒狀常排列呈V、L、X等文字形異染顆?！b別特征無(wú)莢膜、無(wú)芽胞、無(wú)鞭毛白喉棒狀桿菌異染顆粒1000×Neisser染色孔雀綠染色培養(yǎng)特性需氧或兼性厭氧營(yíng)養(yǎng)要求高，含血液、血清、雞蛋的培養(yǎng)基呂氏（Loeffler)血清斜面或雞蛋斜面BAP亞碲酸鉀BAP呂氏（Loeffler)斜面含血清或雞蛋：生長(zhǎng)最快，6h即生長(zhǎng)，10～12h長(zhǎng)出灰白色、濕潤(rùn)、有光澤的光滑型菌苔/菌落菌體形態(tài)典型、異染顆粒明顯，連續(xù)傳代可保持形態(tài)和產(chǎn)毒性能不變BAP：菌落灰白色、光滑型、直徑1～2mm、輕型有狹窄β溶血環(huán)多次傳代后菌體變?yōu)榍蛐蛠嗧谒徕汢AP：黑色菌落各菌型還原能力不同（黑色或灰黑色）根據(jù)菌落特征及生化反應(yīng)特點(diǎn)重型：2mm~3mm

、中心灰或黑、邊緣鋸齒狀、不溶血、菌落結(jié)實(shí)

中間型＜1mm、灰黑色

、光滑、邊緣整齊、不溶血、菌落中等結(jié)實(shí)

輕型1mm~2mm、深灰至黑色、邊緣整齊、輕微溶血、菌落柔軟液體培養(yǎng)基：菌型不同其生長(zhǎng)特點(diǎn)也不相同重型：有表面菌膜及粗大顆粒沉淀、液體澄清中間型微細(xì)顆粒狀，混濁，沉淀少或無(wú)輕型均勻混濁，有沉淀

生化反應(yīng)：表12-2分解葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、果糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖、甘露糖，一般不分解蔗糖，吲哚（-）、硝酸鹽還原（+）、觸酶（+）、氧化酶（-）、明膠液化（-）尿素（-）重型能分解淀粉、糖原、糊精，遲緩分解蔗糖毒素不耐熱外毒素最主要的致病性質(zhì)三、微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)本采集：分泌物假膜的邊緣咽喉部、鼻腔內(nèi)分泌物或扁桃體粘膜上取雙份如不能及時(shí)檢驗(yàn)，標(biāo)本浸于無(wú)菌生理鹽水或15%甘油生理鹽水保存分離培養(yǎng)，并證明其毒力毒力試驗(yàn)患者或帶菌者咽喉、鼻咽拭子等直接涂片染色鏡檢（單染或G染色+異染顆粒染色）呂氏血清斜面35℃12～18h亞碲酸鉀BAP、35℃24～48hBAP35℃16-18h涂片染色鏡檢(G染色和異染顆粒染色）觀察菌落特點(diǎn)呂氏血清斜面生化反應(yīng)涂片染色鏡檢檢驗(yàn)程序直接涂片染色鏡檢2～3張→G染色、異染顆粒染色初報(bào)“直接涂片檢出形似白喉?xiàng)U菌”

分離培養(yǎng)呂氏血清斜面37℃、8～12h→→涂片染色鏡檢檢出率↑，有助于快速診斷亞碲酸鉀BAP37℃、24～48h，黑色菌落輕、中、重型BAP輕型有β溶血環(huán)，應(yīng)注意與溶血性鏈球菌鑒別鑒定：形態(tài)染色、菌落特點(diǎn)、生化反應(yīng)鑒別棒狀桿菌屬不同的種糖發(fā)酵試驗(yàn)、尿素酶、硝酸鹽還原白喉：葡萄糖（+）、麥芽糖（+）蔗糖（-）毒力試驗(yàn)鑒定致病菌株的重要依據(jù)體外法瓊脂平板毒力試驗(yàn)（Elek平板毒力測(cè)定）SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)對(duì)流電泳體內(nèi)法豚鼠皮內(nèi)注射肉湯48h～72h培養(yǎng)物濾過(guò)液+NS→皮內(nèi)注射肉湯48h～72h培養(yǎng)物濾過(guò)液+抗毒素→皮內(nèi)注射錫克試驗(yàn)（Schicktest）白喉外毒素皮內(nèi)試驗(yàn)致敏紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)測(cè)定血清中抗毒素水平第五節(jié)

分枝桿菌屬

（mycobacterium）共同特征細(xì)長(zhǎng)、略帶彎曲的桿菌含分枝菌酸，有分枝生長(zhǎng)的趨勢(shì)不易著色，加溫或延長(zhǎng)染色時(shí)間

具抗酸性，能抵抗3%鹽酸乙醇的脫色作用需氧菌營(yíng)養(yǎng)要求特殊大多數(shù)生長(zhǎng)緩慢：≥7d個(gè)別菌種目前尚不能人工培養(yǎng)

（麻風(fēng)分枝桿菌）二、生物學(xué)特性形態(tài)染色細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲的桿菌，有分枝生長(zhǎng)趨勢(shì)，單個(gè)、成堆或呈束狀排列革蘭染色不易著色抗酸染色陽(yáng)性細(xì)胞壁外尚有莢膜

（染色時(shí)易損壞）無(wú)鞭毛、無(wú)芽胞細(xì)胞壁有很高的脂質(zhì)含量

培養(yǎng)特性專性需氧菌最適37℃，低于30℃不能生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)要求較高：必須在含血清、卵黃、馬鈴薯、甘油以及某些無(wú)機(jī)鹽類的特殊培養(yǎng)基上常用羅一琴（Lowenstein-Jensen，L-J）生長(zhǎng)緩慢：2w~4w

菌落2w~4w干燥、粗糙、隆起、呈顆粒狀、結(jié)節(jié)狀或菜花狀、乳白色或淡黃色，不透明在液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)較快，一般1w~2w即可生長(zhǎng)管底生長(zhǎng)→沉淀→菌膜有毒力菌株呈束狀生長(zhǎng)生化反應(yīng)不活潑不發(fā)酵糖類觸酶陽(yáng)性熱觸酶陰性非結(jié)核分枝桿菌多為陽(yáng)性硝酸鹽還原試驗(yàn)、煙酸試驗(yàn)和煙酰胺酶試驗(yàn)陽(yáng)性牛分枝桿菌則為陰性抗原性十分復(fù)雜有廣泛的交叉性目前，沒(méi)有一種血清學(xué)技術(shù)能提示分枝桿菌抗原的所有種類。抵抗力較強(qiáng)耐干燥本菌耐酸耐堿

對(duì)濕熱敏感在70％～75％乙醇中數(shù)分鐘即被殺死對(duì)紫外線的抵抗力弱

直射陽(yáng)光下2h~7h可殺滅形態(tài)結(jié)構(gòu)變異粗糙型（R型）→光滑型（S型）

毒力變異強(qiáng)→弱耐藥性變異變異性三、細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)（一）標(biāo)本清晨第一口痰3ml~5ml

或一天晚至清晨咳出的全部痰無(wú)菌抽取腦脊液、胸水、腹水及關(guān)節(jié)液從潰瘍處取膿汁或分泌物糞便尿液：收集24h混合尿痰標(biāo)本前處理①酸處理法加入2~4倍的4%硫酸，液化，適用于接種堿性L-T②堿處理法加入2~4倍量2%氫氧化鈉，該法適用于接種酸性L-J③胰蛋白酶—新潔爾滅法加入1~2倍量的0.1%胰蛋白酶消化，加入1/2量的0.3%新潔爾滅，新潔爾滅與標(biāo)本的接觸時(shí)間不能超過(guò)5min。④NaOH—NALC法加入等量NaOH—NALC消化液，處理后，加入PBS，離心，留沉淀其他標(biāo)本前處理腦脊液、胸水、腹水離心，取沉淀接種取沉淀經(jīng)2%~4%氫氧化鈉處理，除雜菌尿液離心，取沉淀經(jīng)2%~4%氫氧化鈉處理膿液、傷口分泌物加酸或堿等處理（二）涂片染色鏡檢1）直接涂片薄片：取0.01ml涂抹10mm×10mm厚片：取0.1ml涂抹20mm×15mm2）集菌涂片：離心，取沉淀涂片汽油漂浮法齊一尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色染液初染液：碳酸復(fù)紅脫色液：3%鹽酸乙醇復(fù)染液：亞甲藍(lán)稀釋液注意事項(xiàng)初染需加熱，不能沸騰，不能蒸干，冷卻水洗脫色至紅色剛好消退（不超過(guò)10min）

痰涂片要厚，觀察至少100