提能點(diǎn)(三)　基因工程及實(shí)踐應(yīng)用

提能點(diǎn)(三)基因工程及實(shí)踐應(yīng)用（點(diǎn)擊進(jìn)入“專題驗(yàn)收評(píng)價(jià)”）基因工程具體應(yīng)用的過(guò)程及相關(guān)技術(shù)名稱過(guò)程模型相關(guān)技術(shù)基因工程藥物基因工程、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎移植基因工程疫苗基因工程、發(fā)酵工程基因治療基因工程續(xù)表|針|對(duì)|訓(xùn)|練|5.用氨芐青霉素抗性基因(ampr)、四環(huán)素抗性基因(tetr)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是

(

)A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用Pvu

Ⅰ酶切，在含tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用Sph

Ⅰ酶切，可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒是否含有目的基因D.若用Sph

Ⅰ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含amp(氨芐青霉素)和tet的培養(yǎng)基中能形成菌落答案：D

解析：若用HindⅢ酶切質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA連接酶將兩者連接成重組質(zhì)粒，目的基因和質(zhì)粒有正向連接和反向連接兩種連接形式，因此目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，會(huì)破壞氨芐青霉素抗性基因，在含tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落可能是含有目的基因的重組質(zhì)粒，也可能是不含目的基因的普通質(zhì)粒，因此在含tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；DNA凝膠電泳技術(shù)可分離大小不同的DNA分子，若用SphⅠ酶切，由于重組質(zhì)粒和普通質(zhì)粒的堿基對(duì)數(shù)不同，因此可通過(guò)DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒是否含有目的基因，C正確；若用SphⅠ酶切，會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因不受影響，因此攜帶目的基因的受體菌在含amp和tet的培養(yǎng)基中不能存活，D錯(cuò)誤。6.番茄的果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，具有特殊風(fēng)味，深受人們喜愛(ài)，但番茄不抗凍?，F(xiàn)有科研人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將北極海魚(yú)中的抗凍基因轉(zhuǎn)入到了番茄細(xì)胞中，從而成功培育出抗凍番茄。導(dǎo)入目的基因的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，下圖為培育過(guò)程使用的Ti質(zhì)粒，已知Vir區(qū)的基因活化能促進(jìn)T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)若經(jīng)過(guò)誘變，北極海魚(yú)的一條染色體上的抗凍基因發(fā)生了堿基對(duì)的替換，導(dǎo)致抗凍能力大大增強(qiáng)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，________(填“能”或“不能”)區(qū)分突變前后的兩個(gè)抗凍基因，請(qǐng)說(shuō)明理由______________________________________________________。(2)對(duì)于目的基因的獲取，研究人員提取了抗凍蛋白，根據(jù)氨基酸序列分析了mRNA的堿基序列，繼而合成了抗凍基因，通過(guò)這種方法得到的目的基因不含________________、__________________，故無(wú)法自主復(fù)制和表達(dá)。選擇圖示Ti質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體，應(yīng)選擇限制酶______(填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”)，不選其他限制酶的理由是__________________________________________________________________________________________________________________。(3)為篩選成功導(dǎo)入抗凍基因的番茄細(xì)胞，可在培養(yǎng)基中添加____________。將篩選后獲得的番茄細(xì)胞經(jīng)__________過(guò)程形成愈傷組織后，經(jīng)器官發(fā)生途徑或____________途徑發(fā)育形成植株，再在_______條件下篩選出具有抗凍性狀的番茄植株。解析：(1)若基因發(fā)生堿基對(duì)的替換，突變前后基因長(zhǎng)度相同，無(wú)法通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分。(2)通過(guò)題述方法得到的目的基因不含復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子和終止子，故無(wú)法自主復(fù)制和表達(dá)。構(gòu)建重組DNA分子時(shí)，限制酶Ⅰ會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，影響后續(xù)篩選含目的基因的受體細(xì)胞，限制酶Ⅱ會(huì)破壞Vir區(qū)基因影響T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移，因此構(gòu)建重組DNA分子時(shí)，應(yīng)選擇限制酶Ⅲ。(3)在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，可以篩選成功導(dǎo)入抗凍基因的番茄細(xì)胞；將篩選后獲得的番茄細(xì)胞經(jīng)脫分化過(guò)程形成愈傷組織后，經(jīng)過(guò)器官發(fā)生途徑或體細(xì)胞胚發(fā)生途徑發(fā)育形成植株，再在低溫條件下篩選出具有抗凍性狀的番茄植株。答案：(1)不能基因發(fā)生堿基對(duì)的替換，突變前后基因長(zhǎng)度相同，無(wú)法通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分(2)復(fù)制起點(diǎn)啟動(dòng)子和終止子Ⅲ限制酶Ⅰ會(huì)破壞四環(huán)素抗性基因，影響后續(xù)篩選含目的基因的受體細(xì)胞，限制酶Ⅱ會(huì)破壞Vir區(qū)基因，影響T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移(3)四環(huán)素脫分化體細(xì)胞胚發(fā)生低溫專題驗(yàn)收評(píng)價(jià)一、選擇題1.(2023·桐鄉(xiāng)月考)體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)常需要提供類似該細(xì)胞在生物體內(nèi)的環(huán)境條件，培養(yǎng)方式可分為懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)。下列敘述正確的是

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)A.懸浮培養(yǎng)一般使用液體培養(yǎng)基B.貼壁培養(yǎng)一般使用固體培養(yǎng)基C.懸浮培養(yǎng)會(huì)發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象D.血液中淋巴細(xì)胞適合貼壁培養(yǎng)答案：A

解析：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)均采用液體培養(yǎng)基，A正確，B錯(cuò)誤；接觸抑制是體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)貼附型細(xì)胞生長(zhǎng)的特性，C錯(cuò)誤；來(lái)源于血液、淋巴組織的細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞不需要貼附在支持物上，而是呈懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)，D錯(cuò)誤。2.(2023·樂(lè)清期末)試管嬰兒的培育是一項(xiàng)人類胚胎工程技術(shù)，可以給不孕不育家庭解決生育難題。下列有關(guān)試管嬰兒培育過(guò)程的敘述正確的是

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)A.需要給母親注射雌激素進(jìn)行超數(shù)排卵處理B.培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞與獲能的精子在體外進(jìn)行受精C.受精完成后形成的受精卵可在體外直接培育成胎兒D.若想要得到雙胞胎，操作過(guò)程必須用到胚胎分割技術(shù)答案：B

解析：為了獲得更多的卵母細(xì)胞，通常需要給母親注射促性腺激素進(jìn)行超數(shù)排卵處理，A錯(cuò)誤；卵母細(xì)胞需培養(yǎng)成熟后，與獲能的精子在體外進(jìn)行受精，B正確；受精完成后形成的受精卵可在體外進(jìn)行早期胚胎培養(yǎng)，而后在合適的時(shí)期將胚胎移入到母體子宮內(nèi)，繼續(xù)發(fā)育成胎兒，C錯(cuò)誤；若想要得到雙胞胎，不一定用到胚胎分割技術(shù)，還可通過(guò)在母體子宮中植入兩個(gè)胚胎來(lái)實(shí)現(xiàn)，D錯(cuò)誤。3.(2023·北京高考)甲狀旁腺激素(PTH)水平是人類多種疾病的重要診斷指標(biāo)。研究者制備單克隆抗體用于快速檢測(cè)PTH，有關(guān)制備過(guò)程的敘述不正確的是

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)A.需要使用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)B.需要制備用PTH免疫的小鼠C.利用抗原—抗體結(jié)合的原理篩選雜交瘤細(xì)胞D.篩選能分泌多種抗體的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞答案：D

解析：?jiǎn)慰寺】贵w的制備過(guò)程中需要用到動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，如骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)等，A正確；分析題意可知，本操作的目的是制備單克隆抗體用于快速檢測(cè)PTH，為獲得能產(chǎn)生抗PTH抗體的B淋巴細(xì)胞，可用PTH對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，B正確；抗原與抗體的結(jié)合具有特異性，故可利用抗原—抗體結(jié)合的原理篩選雜交瘤細(xì)胞，C正確；雜交瘤細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合之后經(jīng)篩選而得到的，由于一種B淋巴細(xì)胞經(jīng)免疫后只能產(chǎn)生一種抗體，故一般情況下單個(gè)雜交瘤細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體，D錯(cuò)誤。4.(2023·浙江強(qiáng)基聯(lián)盟統(tǒng)測(cè))為統(tǒng)計(jì)葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中酵母菌數(shù)量變化并對(duì)菌種進(jìn)行耐酸性檢測(cè)，取適當(dāng)時(shí)間的發(fā)酵樣品經(jīng)梯度稀釋后再分別接種到不同pH的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。下列敘述正確的是

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)A.應(yīng)在酸性范圍設(shè)置培養(yǎng)基pH梯度B.應(yīng)采用平板劃線法進(jìn)行樣品接種C.需要使用恒溫?fù)u床進(jìn)行振蕩培養(yǎng)D.培養(yǎng)過(guò)程應(yīng)保持無(wú)菌和無(wú)氧條件答案：A

解析：要檢測(cè)菌種的耐酸性，故應(yīng)在酸性范圍設(shè)置培養(yǎng)基pH梯度，A正確；平板劃線法不能計(jì)數(shù)，無(wú)法統(tǒng)計(jì)酵母菌數(shù)量，B錯(cuò)誤；培養(yǎng)基培養(yǎng)一般是靜置(倒置)培養(yǎng)，不需要振蕩，C錯(cuò)誤；培養(yǎng)過(guò)程中為促進(jìn)酵母菌繁殖形成菌落，需要保持有氧條件，D錯(cuò)誤。5.草甘膦是無(wú)選擇性除草劑的有效成分，施用時(shí)也會(huì)“誤傷”作物使其致死，其機(jī)理是抑制與植物多種代謝途徑有關(guān)的EPSP合酶的活性。研究人員試圖培育抗草甘膦作物(矮牽牛)，其流程如圖所示。相關(guān)說(shuō)法正確的是

(

)A.①過(guò)程的目的基因是抑制EPSP合酶的基因B.②過(guò)程可利用農(nóng)桿菌將重組Ti質(zhì)粒的T-DNA導(dǎo)入矮牽牛細(xì)胞C.③過(guò)程運(yùn)用植物體細(xì)胞雜交技術(shù)培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因矮牽牛D.轉(zhuǎn)基因矮牽牛存活說(shuō)明EPSP合酶表達(dá)水平下降有利于抗草甘膦答案：B

解析：草甘膦抑制與植物多種代謝途徑有關(guān)的EPSP合酶的活性，若培育抗草甘膦作物，要提高EPSP合酶的活性，①過(guò)程的目的基因是促進(jìn)EPSP合酶的基因，A錯(cuò)誤；②過(guò)程表示將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，可利用農(nóng)桿菌將重組Ti質(zhì)粒的T-DNA導(dǎo)入矮牽牛細(xì)胞，B正確；③過(guò)程要把細(xì)胞培養(yǎng)成個(gè)體，運(yùn)用了植物組織培養(yǎng)技術(shù)，C錯(cuò)誤；轉(zhuǎn)基因矮牽牛存活說(shuō)明EPSP合酶表達(dá)水平升高有利于抗草甘膦，D錯(cuò)誤。6.(2023·寧波海曙區(qū)期中考)利用傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)制作的果酒、果醋、腐乳、泡菜極大地豐富了人們的飲食。下列說(shuō)法正確的是

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)A.利用的都是天然存在的菌種，均不需要滅菌B.其中只有果酒發(fā)酵利用的微生物種類是真菌C.制作泡菜的壇子加水密封是為了抑制乳酸菌的繁殖D.果酒、果醋發(fā)酵裝置應(yīng)該盡量縮短排氣口膠管長(zhǎng)度，以便順利排氣答案：A

解析：傳統(tǒng)發(fā)酵中，果酒、果醋、腐乳、泡菜的制作都利用了天然存在的菌種，均不需要滅菌，A正確；腐乳制作過(guò)程中有多種微生物參與，其中起主要作用的是毛霉，毛霉屬于真菌，B錯(cuò)誤；制作泡菜的壇子加水密封是為了創(chuàng)造無(wú)氧環(huán)境，促進(jìn)乳酸菌的繁殖，C錯(cuò)誤；果酒、果醋發(fā)酵裝置應(yīng)該盡量增長(zhǎng)排氣口膠管長(zhǎng)度，防止雜菌污染，D錯(cuò)誤。7.(2023·廈門(mén)模擬)甲植物具有由核基因控制的多種優(yōu)良性狀，遠(yuǎn)緣植物乙的細(xì)胞質(zhì)中存在抗除草劑基因，科研人員通過(guò)如圖途徑培育出具有抗除草劑性狀的優(yōu)良品種丙。圖中字母表示過(guò)程、數(shù)字序號(hào)表示細(xì)胞。下列相關(guān)敘述正確的是

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)A.過(guò)程A應(yīng)置于較高滲透壓溶液中處理，再將①②誘導(dǎo)融合成③B.過(guò)程B無(wú)需篩選鑒定，形成雜種細(xì)胞后即可接種到培養(yǎng)基中C.過(guò)程C、D采用固體培養(yǎng)基，添加激素的種類和比例相同D.雜種植株丙為二倍體，其產(chǎn)生的配子均含有抗除草劑基因答案：A

解析：過(guò)程A為去除細(xì)胞壁的過(guò)程，在用酶解法降解細(xì)胞壁之前，用較高滲透壓溶液處理細(xì)胞，有利于完整的原生質(zhì)體的釋放，然后再利用誘導(dǎo)融合的方法將①②誘導(dǎo)融合成③，A正確；過(guò)程B獲得的融合細(xì)胞未必都是由甲的細(xì)胞核和乙的細(xì)胞質(zhì)融合形成的，因而需篩選鑒定，B錯(cuò)誤；過(guò)程C、D分別為脫分化和再分化過(guò)程，這些過(guò)程需要采用固體培養(yǎng)基，且兩過(guò)程中添加激素的比例不同，C錯(cuò)誤；雜種植株丙的細(xì)胞核來(lái)自甲植物頂芽細(xì)胞，故其為二倍體，抗除草劑基因位于細(xì)胞質(zhì)中，故其產(chǎn)生的雄配子幾乎不含有抗除草劑基因，D錯(cuò)誤。8.(2023·嘉興二模)鐮刀形細(xì)胞貧血癥是一種單基因遺傳病，由正常血紅蛋白基因(HbA)突變?yōu)殓牭缎渭?xì)胞貧血癥基因(Hbs)引起，HbA和Hbs的某片段如圖甲。對(duì)胎兒基因檢測(cè)的主要原理是MstⅡ限制酶處理擴(kuò)增后的DNA；加熱使酶切片段解旋，用熒光標(biāo)記的CTGACTCCT序列與其雜交；凝膠電泳分離。圖乙是凝膠電泳后熒光出現(xiàn)的三種可能性。下列敘述錯(cuò)誤的是

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)A.提取胎兒DNA樣品后，擴(kuò)增DNA需要添加特定的引物B.用MstⅡ限制酶處理DNA不充分，可能把正常人誤判為攜帶者C.熒光標(biāo)記序列越長(zhǎng)，圖乙-C中兩個(gè)DNA條帶間的距離越大D.若某胎兒檢測(cè)結(jié)果為圖乙-B，則該胎兒為鐮刀形細(xì)胞貧血癥患者答案：C

解析：引物的作用是作為DNA復(fù)制開(kāi)始時(shí)DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，因此提取胎兒DNA樣品后，擴(kuò)增DNA需要添加特定的引物，A正確。據(jù)圖可知，正常血紅蛋白基因中含有MstⅡ限制酶的酶切位點(diǎn)，而鐮刀形細(xì)胞貧血癥基因中沒(méi)有，用MstⅡ限制酶處理DNA不充分，正常血紅蛋白基因的中間位置可能沒(méi)有被切割，結(jié)果可能與鐮刀形細(xì)胞貧血癥基因結(jié)果一樣，因此可能把正常人誤判為攜帶者，B正確。凝膠電泳中，DNA分子量越大遷移得越慢，因此圖乙-C中兩個(gè)DNA條帶間的距離與切割后DNA分子量的大小有關(guān)，與熒光標(biāo)記序列長(zhǎng)短無(wú)關(guān)，C錯(cuò)誤。分析題圖可知，出現(xiàn)圖乙-ADNA條帶表示含有正常血紅蛋白基因；出現(xiàn)圖乙-BDNA條帶表示含有鐮刀形細(xì)胞貧血癥基因；出現(xiàn)圖乙-CDNA條帶表示含有鐮刀形細(xì)胞貧血癥基因和正常血紅蛋白基因，D正確。二、非選擇題9.(2023·紹興月考)白葉枯病是水稻嚴(yán)重的病害之一，疣粒野生稻對(duì)其具有高度抗性。研究人員利用植物體細(xì)胞雜交技術(shù)，試圖將疣粒野生稻的抗白葉枯病特性轉(zhuǎn)移到栽培稻中。(1)將兩種水稻外植體分別接種在含植物激素的培養(yǎng)基上，經(jīng)____________過(guò)程形成愈傷組織后，用________________酶處理獲得游離的原生質(zhì)體。(2)本研究運(yùn)用的技術(shù)手段依據(jù)的原理是________________________，可用化學(xué)試劑__________人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合。(3)“不對(duì)稱體細(xì)胞雜交法”可以將一個(gè)親本細(xì)胞內(nèi)的部分染色體或染色體上某些片段轉(zhuǎn)移到另一個(gè)親本體細(xì)胞內(nèi)，獲得不對(duì)稱雜種植株。大劑量的X射線能隨機(jī)破壞染色體結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生斷裂、易位、消除等，從而導(dǎo)致細(xì)胞不再持續(xù)分裂。碘乙酰胺能使細(xì)胞質(zhì)中的某些酶失活，抑制細(xì)胞分裂。為了達(dá)到轉(zhuǎn)移抗白葉枯病特性的目的，融合前要用X射線照射__________________的原生質(zhì)體，用碘乙酰胺處理另一親本的原生質(zhì)體。經(jīng)誘導(dǎo)融合后，只有異源融合后的雜種細(xì)胞可持續(xù)分裂形成再生細(xì)胞團(tuán)，原因是__________________________。(4)觀察再生植株細(xì)胞中的染色體，發(fā)現(xiàn)數(shù)目均______(填“少于”或“多于”)兩親本染色體數(shù)目之和，說(shuō)明成功獲得了不對(duì)稱雜種植株。有些雜種植株染色體數(shù)目與栽培稻相同，性狀明顯偏向栽培稻，但也表現(xiàn)出疣粒野生稻的一些特性，推測(cè)這些雜種植株無(wú)多余染色體但具有疣粒野生稻特性的原因是_________________________________。(5)用致病性強(qiáng)的兩種水稻白葉枯病菌株接種，檢測(cè)72株雜種植株的抗性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有40株表現(xiàn)抗性，其中17株對(duì)兩種菌株都表現(xiàn)抗性。綜合染色體數(shù)目及抗性檢測(cè)結(jié)果，應(yīng)優(yōu)先選擇_____________________________________________________的雜種植株進(jìn)行繁育。解析：(1)將兩種水稻外植體分別接種在含植物激素的培養(yǎng)基上，經(jīng)脫分化過(guò)程形成愈傷組織后，用纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁，從而獲得游離的原生質(zhì)體。(2)題述過(guò)程表示的是植物體細(xì)胞雜交技術(shù)，該技術(shù)手段依據(jù)的原理是細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性，可通過(guò)化學(xué)試劑聚乙二醇人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合。(3)分析題意可知，為了達(dá)到轉(zhuǎn)移抗白葉枯病特性的目的，可先用X射線照射疣粒野生稻的原生質(zhì)體，使其部分染色體發(fā)生變異，然后用碘乙酰胺處理另一親本的原生質(zhì)體，經(jīng)誘導(dǎo)融合后，從而獲得雜種細(xì)胞，由于融合后的雜種細(xì)胞補(bǔ)充了細(xì)胞質(zhì)中失活的酶，同時(shí)使細(xì)胞中存在正常染色體(生理互補(bǔ))，細(xì)胞能正常分裂，故異源融合后的原生質(zhì)體可持續(xù)分裂形成再生細(xì)胞團(tuán)。(4)不對(duì)稱雜種植株細(xì)胞中只獲得經(jīng)X射線處理的親本的部分染色體或染色體上某些片段，故觀察再生植株細(xì)胞中的染色體，發(fā)現(xiàn)數(shù)目均少于兩親本染色體數(shù)目之和，說(shuō)明成功獲得了不對(duì)稱雜種植株。有些雜種植株染色體數(shù)目與栽培稻相同，性狀明顯偏向栽培稻，但也表現(xiàn)出疣粒野生稻的一些特性，可能的原因是雜種植株中來(lái)自疣粒野生稻的某些基因通過(guò)染色體易位整合到栽培稻細(xì)胞中。(5)分析題意可知，應(yīng)優(yōu)先選擇染色體數(shù)目和栽培稻相同且對(duì)兩種菌株均表現(xiàn)出抗性的雜種植株進(jìn)行繁育。答案：(1)脫分化纖維素酶和果膠(2)細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性聚乙二醇(3)疣粒野生稻雜種細(xì)胞由于融合，補(bǔ)充了細(xì)胞質(zhì)中失活的酶，同時(shí)使細(xì)胞中存在正常的染色體(生理互補(bǔ))，細(xì)胞能正常分裂(4)少于來(lái)自疣粒野生稻的某些基因通過(guò)染色體易位整合到栽培稻細(xì)胞中(5)染色體數(shù)目和栽培稻相同且對(duì)兩種菌株均表現(xiàn)出抗性10.(2023·溫州三模)水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一種蛋白質(zhì)，是一種優(yōu)良的凝血酶抑制劑，在血栓治療上有著重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。已知天然水蛭素的抗凝血活性較低，產(chǎn)量和來(lái)源有限，某科研團(tuán)隊(duì)擬通過(guò)一定的技術(shù)手段改造水蛭素基因，通過(guò)制備山羊乳腺生物反應(yīng)器獲得活性高、產(chǎn)量大的重組水蛭素?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)水蛭素基因的改造：研究發(fā)現(xiàn)，將水蛭素的第47位天冬酰胺替換為賴氨酸，可以提高其活性。通過(guò)建立功能與結(jié)構(gòu)的聯(lián)系，運(yùn)用__________工程對(duì)水蛭素分子進(jìn)行改造：從預(yù)期的水蛭素功能出發(fā)，設(shè)計(jì)水蛭素的__________________，推測(cè)出其氨基酸序列，再依據(jù)______________________逆推出水蛭素基因的脫氧核苷酸序列，進(jìn)而運(yùn)用基因定點(diǎn)突變技術(shù)改造水蛭素基因。(2)水蛭素基因重組DNA分子的構(gòu)建：應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)改造后的水蛭素基因進(jìn)行擴(kuò)增，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，應(yīng)在引物5′端添加特定限制酶的識(shí)別序列，其目的是_____________________。將水蛭素基因和表達(dá)載體用____________________________酶處理獲得重組DNA分子。(3)山羊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化：將無(wú)菌條件下采集制備的________(填“雌性”或“雄性”)山羊成纖維細(xì)胞懸液作為初始材料進(jìn)行________培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時(shí)間后，加入胰蛋白酶使細(xì)胞變得松散，當(dāng)貼壁細(xì)胞趨于球形時(shí)加入過(guò)量新鮮培養(yǎng)液，目的是終止__________________。將帶有重組DNA分子的脂質(zhì)體與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得含有目的基因的受體細(xì)胞。應(yīng)用PCR技術(shù)可精準(zhǔn)鑒定受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了水蛭素基因，若PCR反應(yīng)出現(xiàn)無(wú)擴(kuò)增條帶的假陰性結(jié)果，可能的原因有哪幾項(xiàng)？__________。A.反應(yīng)溫度不適宜