《快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法》征求意見(jiàn)稿

1T/CIXXXX—2023快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法本文件提供了快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法，該方法采用二維色譜儀系統(tǒng)，包括制備溶液、設(shè)置色譜參數(shù)、實(shí)施檢測(cè)以及計(jì)算含量。本文件適用于快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4技術(shù)方案一種快速監(jiān)測(cè)度洛西汀血藥濃度的方法，采用二維液相色譜儀系統(tǒng)，二維液相色譜儀系統(tǒng)為PM3000系統(tǒng)，包括帶在線脫氣單元的雙三元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、輔助泵、帶有一個(gè)六通閥的柱溫箱和檢測(cè)器DAD。4.1制備溶液制備溶液的方法比較靈活，在這里不做限定。蛋白沉淀劑為硫酸鋅溶液溶液和乙腈的混合物，其中硫酸鋅純度不低于98%，可市售獲得。硫酸鋅溶液的質(zhì)量濃度為3%~5%,硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：（1~10）。4.1.1空白血漿溶液取正常人空白血漿2mL，加入蛋白沉淀劑稀釋定容至10mL，混合后超聲5min，將上述溶液轉(zhuǎn)移至EP管中，于離心機(jī)中以10000rpm離心10min，取其上清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過(guò)濾，得到的濾液作為空白血漿溶液。4.1.2系統(tǒng)適用性溶液取鹽酸度洛西汀對(duì)照品51.64mg（相當(dāng)于度洛西汀46mg精密稱定，加入甲醇溶解，定容至100mL，得到濃度為0.46mg/mL的度洛西汀儲(chǔ)備液；精密量取度洛西汀儲(chǔ)備液1mL至10mL的容量瓶中，用甲醇稀釋定容，得到濃度為46μg/ml的度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10μL46μg/ml的度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL的容量瓶中，加入空白血漿2mL，加入蛋白沉淀劑稀釋定容至10mL，混合后超聲5min，得到每1mL中含46ng的度洛西汀溶液，將上述溶液轉(zhuǎn)移至EP管中，于離心機(jī)中以10000rpm離心10min，取其上清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過(guò)濾，得到的濾液作為系統(tǒng)適用性溶液。4.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液將上述46μg/ml的度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋500倍，得92ng/mL的線性儲(chǔ)備液，采用倍比稀釋法逐級(jí)稀釋得到不同濃度的度洛西汀工作溶液，分別精密量取上述度洛西汀線性儲(chǔ)備液各5mL至10mL、4mL至10mL、3mL至10mL、2mL至10mL、2.5mL至50mL容量瓶中，每個(gè)瓶中加入空白血漿2mL，加入蛋白沉淀劑稀釋定容，混合后超聲5min，將上述溶液分別轉(zhuǎn)移至EP管中，于離心機(jī)中以10000rpm離心10min，取其上清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過(guò)濾，分別得到濃度為46ng/mL、36.8ng/mL、27.6ng/mL、18.4ng/mL、4.6ng/mL作為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按照上述46μg/ml的度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法，另外配制一份27.6ng/mL的度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為含量測(cè)定溶液，用來(lái)按照外標(biāo)法計(jì)算樣品中度洛西汀的濃度。2T/CIXXXX—20234.1.4供試品溶液取正在進(jìn)行鹽酸度洛西汀治療的患者的人體血漿2mL至10mL的容量瓶中，加入蛋白沉淀劑混勻并稀釋定容，混合后超聲5min，將上述溶液轉(zhuǎn)移至EP管中，于離心機(jī)中以10000rpm離心10min，取其上清液，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過(guò)濾，得到的濾液作為供試品溶液。4.2設(shè)置色譜參數(shù)在二維液相色譜儀系統(tǒng)系統(tǒng)上設(shè)置一維柱色譜條件的參數(shù)、二維柱色譜條件的參數(shù)和大體積進(jìn)樣條件的參數(shù)和閥切換條件的參數(shù)，并使用空白血漿溶液和系統(tǒng)適用性溶液確認(rèn)，待二維液相色譜儀系統(tǒng)系統(tǒng)的壓力和基線平衡穩(wěn)定后，注入不少于5針空白血漿溶液和系統(tǒng)適用性溶液用來(lái)確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)用的二維液相色譜儀系統(tǒng)為PM3000系統(tǒng)，包括帶在線脫氣單元的雙三元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、輔助泵、帶有一個(gè)六通閥的柱溫箱和檢測(cè)器，上述雙三元梯度泵包括一維泵和二維泵，一維泵用于在線固相萃取，二維泵用于色譜分析，吸附在一維柱的度洛西汀通過(guò)六通閥切換到分析流路中，可以將原來(lái)用4~5h進(jìn)行固相萃取前處理的樣品縮短至3min左右在線完成，凈化和濃縮后的度洛西汀樣品直接進(jìn)行定量分析。上述六通閥設(shè)置的閥口位置順序?yàn)殚y1、閥2、閥3、閥4、閥5和閥6。如圖1，一維柱色譜條件和二維柱色譜條件通過(guò)閥切換技術(shù)的系統(tǒng)配合的工作原理如下：a)一維洗脫液通過(guò)一維泵由閥2接口進(jìn)入，閥2接口切換經(jīng)閥1接口，經(jīng)與閥1和閥4通過(guò)管線相連的一維柱實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的富集濃縮，多余的一維洗脫液，由閥4接口切換經(jīng)閥3接口至閥3接口經(jīng)管線排出；b)富集的餾分待測(cè)物由閥4接口切換經(jīng)閥5接口，二維洗脫液通過(guò)二維泵由閥6接口進(jìn)入，閥6接口切換經(jīng)閥1接口，使得一維柱以正向模式與二維柱串聯(lián)，乙腈-0.05mmol磷酸二氫鉀（PH=6.0）緩沖液作為洗脫液將餾分待測(cè)物從一維柱上洗脫下來(lái)，經(jīng)管線由閥5接口進(jìn)入二維柱進(jìn)行進(jìn)一步分離，分離的待測(cè)物經(jīng)所述檢測(cè)器檢測(cè)后由管線排出，檢測(cè)器通過(guò)信號(hào)傳輸轉(zhuǎn)化在計(jì)算機(jī)上顯示出相應(yīng)的色譜圖。在上述PM3000系統(tǒng)中的自動(dòng)進(jìn)樣器的最大進(jìn)樣體積為1000μL，可以連續(xù)進(jìn)樣富集待測(cè)物質(zhì)，通常對(duì)于一維HPLC而言進(jìn)樣體積過(guò)大會(huì)嚴(yán)重導(dǎo)致色譜峰擴(kuò)展而影響分離度進(jìn)而降低靈敏度，設(shè)計(jì)了通過(guò)大體積進(jìn)樣來(lái)提高本方法的靈敏度。大體積的樣品先流經(jīng)一維柱富集在柱頂端，然后再經(jīng)過(guò)一維洗脫液洗脫血漿樣品中的大分子蛋白成分和其他雜質(zhì)，通過(guò)正向切閥流入到二維柱中進(jìn)行分離和定量分析。由于樣品溶劑中含有高比例的有機(jī)3T/CIXXXX—2023溶劑，所以用了大體積泵進(jìn)水稀釋，確保被測(cè)物質(zhì)在一維柱上富集不流出，由于進(jìn)樣體積較大，容易導(dǎo)致色譜峰擴(kuò)展及變形，采用一維柱富集純化后洗脫液正方向切閥，進(jìn)行洗脫后再流經(jīng)至二維柱，并設(shè)計(jì)了輔助泵在一維柱富集純化期間注入純化水，使一維柱中的待測(cè)成分充分保留，這樣就可實(shí)現(xiàn)大體積進(jìn)樣也不會(huì)使色譜峰峰型變寬。而且，輔助泵注入純水的程序?yàn)椋?-3min，流速為1.2mL/min；3-3.1min，流速由1.2mL/min改變?yōu)?.1mL/min；3.1-14.5min，流速為0.1mL/min；14.5-14.8min，流速由0.1mL/min改變?yōu)?.2mL/min；14.8-15.0min，流速為1.2mL/min。為了能夠在短時(shí)間（3分鐘內(nèi)）純化富集血漿中的有效成分，對(duì)一維柱的填充劑材料基質(zhì)要求有很好的親水性，因?yàn)檠獫{中含有血細(xì)胞和大分子的蛋白，這就需要色譜純化分離有分子排阻和色譜分配兩種模式同時(shí)存在，并結(jié)合度洛西汀與填充劑材料的相互作用，在本實(shí)施例中，具體的一維柱為NNJW16851Cat.No.12439MFPh-1S-5固相萃取柱，規(guī)格為4.0mml.D.×20mm，針對(duì)度洛西汀的化合物結(jié)構(gòu)，對(duì)二維柱的填充劑材料基質(zhì)的表面要求有很好的親水性，二維柱的雙封端技術(shù)優(yōu)良，依據(jù)度洛西汀在二維柱中的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，使得度洛西汀具有較好的分離度，可以選擇填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠的色譜柱，具體的二維柱為Unisil3-120C18UltraQCS180425色譜柱，規(guī)格為SS4.6mm×100mm，其填料中硅醇基活性極低，該色譜柱具有優(yōu)良的穩(wěn)定性和耐用性，使用壽命達(dá)1000針次以上。進(jìn)一步的，在二維液相色譜儀系統(tǒng)上設(shè)置的色譜參數(shù)應(yīng)符合表1。表1色譜參數(shù)NNJW16851Cat.No.12439MFPh-1Unisil3-120C18UltraQCS二維流動(dòng)相A：乙腈；二維流動(dòng)相B：0.05mmol磷酸二氫鉀，00NOTimeValvel123為了核實(shí)二維液相色譜儀系統(tǒng)具有良好的分離度和精確度，以勝任將要實(shí)施的檢測(cè)工作，在進(jìn)樣空白血漿溶液后，重復(fù)進(jìn)樣系統(tǒng)適用性溶液并將所測(cè)結(jié)果與本文件中的要求進(jìn)行比較，如果符合，后續(xù)的供試品檢測(cè)分析則可以繼續(xù)進(jìn)行。在本實(shí)施例中，對(duì)系統(tǒng)適用性溶液的要求為空白血漿溶液的色譜圖中不能有度洛西汀峰的干擾峰，系統(tǒng)適用性溶液中的度洛西汀色譜峰與其他物質(zhì)色譜峰的分離度不小于1.5，度洛西汀峰純度閾值不小于0.990，重復(fù)進(jìn)樣5針度洛西汀峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)不得過(guò)1%。4.3實(shí)施檢測(cè)4T/CIXXXX—20234.6ng/mL、18.4ng/mL、27.6ng/mL、36.8ng/mL、46.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和供試品溶液分別注入所述二維液相色譜儀，各進(jìn)樣1針，記錄色譜圖時(shí)間15分鐘。4.4計(jì)算含量分析得到所有標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液對(duì)應(yīng)的度洛西汀的峰面積，將上述結(jié)果通過(guò)加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到度洛西汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=ax+b，其中，y為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液對(duì)應(yīng)的度洛西汀的峰面積，x為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中度洛西汀的濃度，得到的線性方程為：y=0.063x-0.0099，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9999。在上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，按外標(biāo)法計(jì)算得到供試品溶液中度洛西汀的含量。計(jì)算公式為：血漿樣品中度洛西汀的濃度=供試品中度洛西汀的峰面積*度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)品濃度*稀釋倍數(shù)/度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)品峰面積。考察了不同配比、不同濃度硫酸鋅溶液的蛋白質(zhì)沉淀劑對(duì)方法檢測(cè)結(jié)果的影響：a)試驗(yàn)組1，0.3%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；b)試驗(yàn)組2，0.4%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；c)試驗(yàn)組3，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；d)試驗(yàn)組4，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：1；e)試驗(yàn)組5，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；f)試驗(yàn)組6，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：4；g)試驗(yàn)組7，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：6；h)試驗(yàn)組8，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：8；i)對(duì)比例1，0.2%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；j)對(duì)比例2，0.6%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：3；k)對(duì)比例3，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為2：1；l)對(duì)比例4，0.5%硫酸鋅溶液與乙腈的體積比為1：11；m)對(duì)比例5，乙腈1000μL；考察回收率，結(jié)果應(yīng)符合表2。表2不同配比的蛋白沉淀劑對(duì)方法回收率的影響由表2可知，試驗(yàn)組1～試驗(yàn)組8提供的蛋白沉淀劑可保證本發(fā)明的方法回收率在95%～105%之間，采用0.5%的硫酸鋅溶液，與乙腈的體積比在1：4～1：6范圍內(nèi)時(shí)，可保證本發(fā)明的方法回收率在98%～102%之間?？疾炝顺晻r(shí)間對(duì)方法回收率的影響，超聲時(shí)間不能少于3min，在超聲的作用下，硫酸鋅水溶液的溶劑化作用更有利于血漿中度洛西汀的提取，乙腈可以更好的輔助將蛋白沉淀下來(lái)，時(shí)間過(guò)短不利于度洛西汀的提取，導(dǎo)致方法回收率偏低，不準(zhǔn)確，為了獲得準(zhǔn)確度更高和操作方便，選擇超聲時(shí)間5min。如圖2-3所示，系統(tǒng)適用性測(cè)試實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為空白血漿溶液的色譜圖中沒(méi)有出現(xiàn)度洛西汀干擾峰，系統(tǒng)適用性溶液的色譜圖中與度洛西汀峰最近的雜質(zhì)峰的分離度為2.0，大于1.5，符合本方法的要求，從而驗(yàn)證了本方法專屬性強(qiáng)。5T/CIXXXX—2023如圖4所示，靈敏度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為本方法的定量下限為2.3ng，表明本方法靈敏度高。6T/CIXXXX—2023如圖5所示，線性范圍實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為本方法的線性范圍為：4.6ng/mL-4