微小亞歷山大藻產(chǎn)毒特性研究

微小亞歷山大藻產(chǎn)毒特性研究

從20世紀(jì)開(kāi)始，赤潮在世界范圍內(nèi)頻繁發(fā)生，直接或間接地影響著漁業(yè)、沿海旅游業(yè)和食品安全，損害了海洋生態(tài)系統(tǒng)。赤潮毒素中麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)是已知對(duì)人類生命健康構(gòu)成威脅的海洋藻毒素中影響最大、分布最廣泛、危害最大的一種。亞歷山大藻作為PSP重要產(chǎn)毒藻,與大多數(shù)麻痹性中毒事件密切相關(guān)。隨著近年我國(guó)沿海經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,近海水體污染日趨嚴(yán)重,亞歷山大藻在近岸水體和底泥中經(jīng)常出現(xiàn)。微小亞歷山大藻是我國(guó)沿海有毒甲藻中PSP的主要產(chǎn)毒藻之一,其生長(zhǎng)和毒性受到各種環(huán)境因子的影響,其中N、P營(yíng)養(yǎng)鹽的影響最為顯著。N、P營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)亞歷山大藻產(chǎn)毒影響的早期研究,集中在對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的濃度及種類做一定調(diào)整,改變?cè)宓呐囵B(yǎng)因子,進(jìn)行一代培養(yǎng)及檢測(cè)產(chǎn)毒情況。實(shí)際海水中的N、P營(yíng)養(yǎng)鹽濃度和比例是動(dòng)態(tài)變化的,而微小亞歷山大藻對(duì)N營(yíng)養(yǎng)鹽和P營(yíng)養(yǎng)鹽的利用狀況相關(guān)并相互作用。到目前為止,還很少見(jiàn)有關(guān)微小亞歷山大藻在N多P少或P多N少的情況下,即N、P比例失調(diào)條件下,產(chǎn)毒能力隨世代增加的變化規(guī)律。本文通過(guò)調(diào)整N、P比例,研究了當(dāng)一種營(yíng)養(yǎng)鹽成為制約因素時(shí),其對(duì)亞歷山大藻產(chǎn)毒做何影響。改變?cè)宓呐囵B(yǎng)條件并且連續(xù)進(jìn)行了三個(gè)世代的培養(yǎng),研究長(zhǎng)期N、P比例失調(diào)的培養(yǎng)條件,對(duì)微小亞歷山大藻產(chǎn)毒能力的影響隨藻世代增加的累積效果。并且動(dòng)態(tài)跟蹤了每個(gè)世代前后,培養(yǎng)基中N、P濃度的變化,分析產(chǎn)毒藻對(duì)N、P營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收情況,將不同比例下藻對(duì)N、P吸收量的變化與藻細(xì)胞產(chǎn)毒能力做了對(duì)照分析。1材料和方法1.1陳海水來(lái)源及其分布實(shí)驗(yàn)用微小亞歷山大藻(Alexandriumminutum),由近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海洋微型生物保種中心(CCMBP)提供,培養(yǎng)基為f/2的改良配方,其中陳海水來(lái)源為東海自然海水,由國(guó)家海洋局東海監(jiān)測(cè)中心提供,pH值為8.1±0.1,鹽度為25±1。培養(yǎng)溫度為21℃,光周期L∶D=12h∶12h。用于毒素分析的4種PSP標(biāo)準(zhǔn)樣品(GTX14,GTX23,C12,STX)均網(wǎng)購(gòu)自加拿大海洋生物研究所(NationalResearchCouncilofCanada,NRCC)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1n、p營(yíng)養(yǎng)鹽比例以f/2培養(yǎng)基中N、P營(yíng)養(yǎng)鹽比例為基準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整,設(shè)定1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10;1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1,20個(gè)不同比例N、P營(yíng)養(yǎng)鹽比例(其中NO3-N的單位濃度為54.7mg/L、總磷(TP)的單位濃度為3.42mg/L,氮源:NaNO3,磷源:NaH2PO4·H2O)對(duì)微小亞歷山大藻培養(yǎng)。為研究不同N、P濃度比例培養(yǎng)的累計(jì)效應(yīng),進(jìn)行了20個(gè)N、P比例進(jìn)行了連續(xù)三個(gè)世代的培養(yǎng),培養(yǎng)周期為25d,每3d取一次樣計(jì)數(shù),采用魯哥氏液固定后顯微鏡平板計(jì)數(shù)法,每次取樣設(shè)三個(gè)重復(fù),進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的繪制,并在細(xì)胞濃度最大時(shí),對(duì)藻液產(chǎn)毒情況進(jìn)行定性定量分析。1.2.2提取并分離純度國(guó)外的毒素(1)pvc萃取產(chǎn)物mL新鮮藻液,經(jīng)探針式超聲破碎5min,鏡檢確定細(xì)胞壁已破碎,離心取上清液,添加5mL0.0lmol乙酸溶液,沸水浴萃取10min,離心后得上清液,為PSP粗萃取產(chǎn)物。(2)a型毒分離液s1取PSP粗萃取物過(guò)C18柱,所得毒素分離液主要含GTX14、STX。C18柱分離液再過(guò)陽(yáng)離子交換柱純化分離,所得毒素分離液主要含C12。再加0.3mol/LNaCl淋洗陽(yáng)離子交換柱,所得洗脫液主要含GTX23。(3)ch品種、配合物的ph值,5.3moolh4的降解0.03mol/LHIO4,0.3mol/lCH3COONH4,0.3mol/LNa2HPO4,按1∶1∶1比例配成,調(diào)節(jié)pH=8.3,室溫氧化15min后上機(jī)分析。1.2.3熒光分離器ro實(shí)驗(yàn)分析方法參考柱前衍生高效液相色譜AOAC官方分析方法,并對(duì)分析條件優(yōu)化調(diào)整。儀器為島津公司的LC-10Avp系統(tǒng),采用WatersC18反相柱:319mm×150mm、柱溫40℃,流速1.0mL/min。梯度洗脫方法:流動(dòng)相A:0.1mol/L甲酸胺;流動(dòng)相B:0.1mol/L甲酸胺5%乙腈水溶液;均用冰乙酸調(diào)整pH為5.5。走峰時(shí)間15min,洗脫梯度為:0～5minBconv.5%;5～9minBconv.70%,9～13minBconv.30%,13～15minBconv.5%。熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為340nm、發(fā)射波長(zhǎng)為390nm。進(jìn)樣量為100μL、出峰時(shí)間集中在3～6min,8～10min。1.2.4兩種吸收量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別測(cè)定了微小亞歷山大藻三個(gè)生長(zhǎng)周期前后的培養(yǎng)基中N、P濃度,從而得到微小亞歷山大藻對(duì)二者吸收量的變化。主要測(cè)定了NO3-N、NO2-N、NH4-N、TP四個(gè)指標(biāo),由于投放的N營(yíng)養(yǎng)鹽都是以硝態(tài)N存在的,且均未檢測(cè)到NH4-N存在,NO2-N的量比NO3-N低了3個(gè)數(shù)量級(jí)以上,因此,認(rèn)定NO3-N的吸收量為微小亞歷山大藻對(duì)N的吸收量。2結(jié)果與討論2.1產(chǎn)毒能力分析幾種PSP毒素經(jīng)過(guò)SPE柱分離后,主峰出峰時(shí)間可以明顯分離開(kāi)來(lái),均檢測(cè)到有GTX14、GTX23、C12、STX產(chǎn)生,但其產(chǎn)毒種類和毒素組成比例無(wú)固定規(guī)律,本文主要以PSP產(chǎn)生總量(pg/cell)作為產(chǎn)毒能力的衡量指標(biāo)。不同N,P比例培養(yǎng)的3代微小亞歷山大藻產(chǎn)毒總量的分布情況如表1所示。2.2藻n、p的吸收曲線N,P比例變化時(shí),隨TP濃度變大,3代微小亞歷山大藻P,N的吸收情況,如圖1所示,隨TN濃度變大,3代微小亞歷山大藻N、P的吸收情況,如圖2所示。以上曲線可以看出,微小亞歷山大藻在P過(guò)量時(shí),隨著TP濃度的線性增加,其吸收量成比例增加,而對(duì)N的吸收量呈曲線波動(dòng),反之,在N過(guò)量時(shí),N的吸收量亦成比例增加,而對(duì)P的吸收量呈曲線波動(dòng)?？芍环N營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的線性升高,其吸收量隨之成比例增長(zhǎng),但不能促進(jìn)或抑制對(duì)另一種營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收率。2.3生物處理對(duì)藻體產(chǎn)毒能力的影響20個(gè)不同N,P比例下,3代微小亞歷山大藻產(chǎn)毒能力變化,如圖3所示,并通過(guò)三代平均的產(chǎn)毒情況,反映微小亞歷山大藻產(chǎn)毒能力隨N、P比例調(diào)整,總體的產(chǎn)毒變化趨勢(shì)。由三代平均藻細(xì)胞產(chǎn)毒能力曲線可看出,微小亞歷山大藻在N、P比例變化時(shí),仍然能正常生長(zhǎng)產(chǎn)毒,三代培養(yǎng)具有一定重現(xiàn)性。隨N、P比例的不同,產(chǎn)毒能力均呈現(xiàn)曲線形式波動(dòng);通過(guò)比較三代藻細(xì)胞產(chǎn)毒能力曲線可看出,微小亞歷山大藻在N、P比為1∶4、4∶1時(shí),產(chǎn)毒能力較強(qiáng),隨藻世代增加,產(chǎn)毒變化的累積效應(yīng)變緩和,產(chǎn)毒能力整體隨世代增加變?nèi)酢＝Y(jié)合前面產(chǎn)毒藻對(duì)N、P吸收情況的分析,藻對(duì)過(guò)量營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收量隨濃度增加而線性增加,對(duì)不足量的營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收量呈現(xiàn)曲線變化,同時(shí)其產(chǎn)毒情況亦為曲線變化,可推斷,當(dāng)N、P比例失調(diào)時(shí),量不足的營(yíng)養(yǎng)鹽為制約性因素,直接影響藻的產(chǎn)毒能力。2.4營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)小球藻產(chǎn)毒能力的影響為深入探索藻細(xì)胞產(chǎn)毒變化與制約性營(yíng)養(yǎng)鹽吸收量的關(guān)系,下圖將二者關(guān)系進(jìn)行了對(duì)照,并做了相關(guān)性分析,其中對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽吸收量、產(chǎn)毒能力,均指三代平均水平,如圖4和圖5所示。經(jīng)SPSS軟件計(jì)算,得出圖4兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)為0.145,圖5相關(guān)系數(shù)為0.396。結(jié)果表明對(duì)兩種制約性營(yíng)養(yǎng)鹽的吸收,同藻的產(chǎn)毒能力均呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系。既吸收量越多,產(chǎn)毒能力越強(qiáng),但相關(guān)關(guān)系不明顯,一定原因上由于兩者數(shù)據(jù)的數(shù)量級(jí)差別較大,其變化趨勢(shì)無(wú)法嚴(yán)格對(duì)應(yīng),同時(shí)藻的產(chǎn)毒受很多環(huán)境影響因子的影響,無(wú)法完全消除其他因素如細(xì)菌類微生物的干擾。具體的機(jī)理,還有待在以后的研究里,進(jìn)一步探索。影響亞歷山大藻生長(zhǎng),產(chǎn)毒的環(huán)境因子較復(fù)雜,本次研究主要針對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽方面,對(duì)微小亞歷山大藻在N、P失調(diào)時(shí)產(chǎn)毒變化情況進(jìn)行了初步探索。主要得出以下結(jié)論:(1)微小亞歷山大藻在N、P失調(diào)的培養(yǎng)條件下,仍然能在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定地的生長(zhǎng)產(chǎn)毒,隨N、P比例的線形變化,產(chǎn)毒能力呈現(xiàn)曲線形式波動(dòng)。(2)當(dāng)一種營(yíng)養(yǎng)鹽過(guò)量時(shí),投放量相對(duì)不足的營(yíng)養(yǎng)鹽成為影響產(chǎn)毒的制約性因素,其吸收量同細(xì)胞產(chǎn)