生物化學(xué)課件：12核酸的生物合成

一、DNA的生物合成二、RNA的生物合成第十二章核酸的生物合成生物體的遺傳信息儲(chǔ)存在DNA中，并通過(guò)DNA的復(fù)制由親代傳給子代。在子代的生長(zhǎng)發(fā)育中遺傳信息自DNA轉(zhuǎn)錄給RNA，然后翻譯成蛋白質(zhì)以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳性狀。

1958年，F(xiàn).Crick提出中心法則：

（1）以原DNA分子為模板，合成出相同DNA分子的過(guò)程。

（2）以某一段DNA分子為模板，合成出與其序列對(duì)應(yīng)的RNA分子的過(guò)程。

（3）以mRNA為模板，根據(jù)三聯(lián)密碼規(guī)則，合成對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的過(guò)程。

中心法則揭示了生物體內(nèi)遺傳信息的傳遞方向。中心法則一DNA的生物合成DNA生物合成有兩種方式：DNA復(fù)制和反轉(zhuǎn)錄

DNA體內(nèi)復(fù)制涉及：原核、真核生物的染色體、細(xì)菌質(zhì)粒（環(huán)狀，雙鏈）、真核細(xì)胞器DNA（線粒體、葉綠體）、病毒（雙鏈，環(huán)狀）

DNA的體外復(fù)制：分子克隆。1.1DNA的半保留復(fù)制DNA的半保留復(fù)制(semiconservativereplication)Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)即推測(cè)，DNA在復(fù)制時(shí)首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開(kāi)，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。2居中重輕0134

DNA的半保留復(fù)制的證明(1)1958年，Meselson和Stahl用15N標(biāo)記E.coli.DNA，證明了DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制。

DNA的半保留復(fù)制的證明(2)1.2DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方向1.2.1起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn)是以一條鏈為模板起始DNA合成的一段序列。有時(shí)，兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)并不總是在同一點(diǎn)上（如D環(huán)復(fù)制）。

在一個(gè)完整的細(xì)胞周期中，每一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)只使用一次，完成一次復(fù)制過(guò)程。

多數(shù)生物的復(fù)制起點(diǎn)，都是DNA呼吸作用強(qiáng)烈（甲醛變性實(shí)驗(yàn)）的區(qū)段，即經(jīng)常開(kāi)放的區(qū)段，富含A.T。1.2.2方向定點(diǎn)起始，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的（等速進(jìn)行或異速進(jìn)行），形成兩個(gè)復(fù)制叉，少數(shù)是單向復(fù)制，形成一個(gè)復(fù)制叉?！镉梅派渥燥@影實(shí)驗(yàn)判斷DNA的復(fù)制方向及速度

低放射性3H-脫氧胸苷

高放射性3H-脫氧胸苷a.單向

b.雙向等速三種結(jié)果圖形

c.雙向異速

E.coli.的一個(gè)溫度敏感株，在42℃時(shí)，能使DNA在完成復(fù)制后，不再開(kāi)始新的復(fù)制過(guò)程，而在25℃時(shí)復(fù)制功又能能恢復(fù)。

DNA的幾種復(fù)制方式直線雙向復(fù)制

單點(diǎn)，雙向，T7

多點(diǎn)，雙向，真核染色體DNAθ型復(fù)制：環(huán)狀雙鏈DNA，單向或雙向（E.coli.）滾環(huán)復(fù)制：環(huán)狀單鏈DNA，Φx174D環(huán)復(fù)制：線粒體、葉綠體DNA多復(fù)制叉復(fù)制：

第一輪復(fù)制尚未完成，復(fù)制起點(diǎn)就開(kāi)始第二輪的復(fù)制。

在E.coli.富營(yíng)養(yǎng)時(shí)，可采取多復(fù)制叉復(fù)制方式。E.coli.DNA的復(fù)制最快可達(dá)50Kb/min，完全復(fù)制需40min，富營(yíng)養(yǎng)時(shí)，20min分裂。而真核染色體要6-8小時(shí)。

DNA的幾種復(fù)制方式(圖)復(fù)制單位

復(fù)制子(Replicon)基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位每個(gè)復(fù)制子都含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。

原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子，它們都是單復(fù)制子，都在一個(gè)固定的起點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制，復(fù)制方向大多數(shù)是雙向的，少數(shù)是單向復(fù)制。多數(shù)是對(duì)稱(chēng)復(fù)制，少數(shù)是不對(duì)稱(chēng)復(fù)制（一條鏈復(fù)制后才進(jìn)行另一條鏈的復(fù)制）。

環(huán)狀DNA的復(fù)制眼象θ，稱(chēng)θ形復(fù)制。

真核生物的染色體DNA是線形雙鏈分子，含有許多復(fù)制起點(diǎn)，因此是多復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子約有100-200Kbp。人體細(xì)胞平均每個(gè)染色體含有1000個(gè)復(fù)制子。

病毒DNA多種多樣，環(huán)狀或線形，雙鏈或單鏈，但都是單復(fù)制子。與DNA復(fù)制有關(guān)的酶及蛋白質(zhì)因子

DNA的聚合反應(yīng)和聚合酶引物酶或RNA聚合酶（引發(fā)酶）解螺旋酶

DNA旋轉(zhuǎn)酶單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）DNA連接酶（ligase)

DNA的聚合反應(yīng)和聚合酶

DNA聚合反應(yīng)必備的條件聚合反應(yīng)過(guò)程聚合反應(yīng)特點(diǎn)

DNA聚合酶1、

DNA聚合反應(yīng)必備的條件

DNA聚合酶

DNA模板(反轉(zhuǎn)錄時(shí)用RNA模板引物(DNA、RNA或蛋白質(zhì))4種dNTP

Mg2+

2、

聚合反應(yīng)過(guò)程在鏈的延長(zhǎng)過(guò)程中，鏈的游離3，-羥基，對(duì)進(jìn)入的脫氧核糖核苷三磷酸α磷原子發(fā)生親核攻擊，生成3，.5，-磷酸二酯鍵，并脫下焦磷酸。3、

聚合反應(yīng)特點(diǎn)DNA聚合酶的反應(yīng)特點(diǎn)：

⑴以4種dNTP為底物

⑵反應(yīng)需要接受模板的指導(dǎo)，不能催化游離的dNTP的聚合。

⑶反應(yīng)需有引物3，-羥基存在

⑷鏈生長(zhǎng)方向5，→3，

⑸產(chǎn)物DNA的性質(zhì)與模板相同4、

DNA聚合類(lèi)型發(fā)莢環(huán)結(jié)構(gòu)：加入單鏈DNA作為模板和引物，3‘羥基端回折成引物鏈。末端延伸聚合：加入雙鏈DNA作為模板和引物，3’末端突出作為模板。分枝型和切口平移型聚合：加入雙鏈DNA，聚合發(fā)生在切口或末端單鏈區(qū)。環(huán)形聚合：加入帶引物的環(huán)形DNA作為模板。

1.3原核細(xì)胞DNA的復(fù)制雙鏈DNA復(fù)制的分子機(jī)制：岡崎片斷和半不連續(xù)復(fù)制岡崎片斷和RNA引物

DNA連接酶母本DNA雙鏈的分離聚合酶的校對(duì)作用1.3.1E.coliDNA聚合酶

E.coli.DNApol.I（Kornberg酶，400copy/cell）E.coli.DNAPol.Ⅱ（100copy/cell)E.coli.NApol.Ⅲ（復(fù)制酶，10-20copy/cell）單體酶，分子量109Kd，含一個(gè)Zn2+，每個(gè)細(xì)胞中含400個(gè)DNApol.Ⅰ

催化活性：

5，→3，

聚合活性

3，→5，

外切活性

5，→3，

外切活性用蛋白水解酶將DNApol.Ⅰ部分水解可得：

大片段（Klenow），75Kd，活性：5，→3，聚合活性、3，→5，外切活性。

小片段，36Kd，活性：5，→3，外切活性（只作用于雙鏈DNA的堿基配對(duì)部分，切除修復(fù)）。Klenow片段的用途：a補(bǔ)齊DNA3，隱縮未端

b.標(biāo)記DNA片段未端

c．cDNA合成第二鏈

d．dDNA測(cè)序

E.coli.DNApol.I單體酶，分子量120Kd

催化活性：5，→3，聚合(活性很低)

3，→5，外切可能在DNA的修復(fù)中起某中作用

E.coli.DNAPol.Ⅱ寡聚酶，全酶由10種共22個(gè)亞基組成，α、ε和θ三種亞基組成核心酶。

DNApol.Ⅲ是合成新鏈DNA主要的酶，又稱(chēng)復(fù)制酶(Replicase)

Pol.Ⅲ的5，→3，外切酶活性只作用于單鏈DNA。

E.coli.DNApol.Ⅲ

E.coli.DNApol.Ⅲ的組成

E.coli三種DNA聚合酶的性質(zhì)比較

DNA聚合酶Ⅰ

DNA聚合酶Ⅱ

DNA聚合酶Ⅲ分子量109KD120KD＞600KD每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)40017-10010-205′→3′聚合活性+++37℃轉(zhuǎn)化率核苷酸數(shù)／酶分子·分鐘6003030,0005′→3′外切活性+--3′→5′外切活性+++切刻平移活性+--對(duì)dNTP親和力低低高功能修復(fù)復(fù)制修復(fù)去除引物填補(bǔ)空缺

引物酶或RNA聚合酶（引發(fā)酶）

細(xì)胞內(nèi)，DNA的復(fù)制需要引物（DNA或RNA），引物酶或RNA聚合酶可合成6-10個(gè)堿基的RNA引物。

★DNA復(fù)制為什么要用RNA引物？（為什么DNA聚合酶要用引物，RNA聚合酶不需要引物？）⑴從模板復(fù)制最初幾個(gè)核酸時(shí)，堿基堆集力和氫鍵都較弱，易發(fā)生錯(cuò)配

⑵新復(fù)制的最初幾個(gè)核苷酸，沒(méi)有與模板形成穩(wěn)定雙鏈，DNA聚合酶的5，→3，校對(duì)功能難發(fā)揮作用。

解螺旋酶

大腸桿菌的解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ與rep蛋白共同作用，將DNA兩條鏈解開(kāi)。

解螺旋酶I、II、III沿著模板鏈的5’→3’方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，而rep蛋白則在另一條模板鏈上沿3’→5’方向移動(dòng)。

DNA旋轉(zhuǎn)酶屬DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，可引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)帶來(lái)的扭曲張力。

拓?fù)洚悩?gòu)酶分兩類(lèi)：I和II，廣泛存在于原核生物和真核生物。

拓?fù)洚悩?gòu)酶I使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無(wú)須供給能量，主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ使DNA的兩條鏈同時(shí)斷裂和再連接，當(dāng)它引入超螺旋時(shí)需要由ATP供給能量。分布在染色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)部，與復(fù)制有關(guān)。

單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）

復(fù)制叉上的解螺旋酶，沿雙鏈DNA前進(jìn)，產(chǎn)生單鏈區(qū)，大量的單鏈DNA結(jié)合蛋白與單鏈區(qū)結(jié)合，阻止復(fù)性和保護(hù)單鏈DNA不被核酸酶降解。

DNA連接酶（ligase）連接雙鏈DNA上的切口。

大腸桿菌連接酶只能在模板上連接DNA缺口。T4DNAligase即可連接粘性末端的DNA，又可連接平齊末端的雙鏈DNA。

E.coli.和其它細(xì)菌的DNAligase以NAD為能源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體DNAligase以ATP為能源。

DNA連接酶（ligase)的作用

DNA連接酶的作用機(jī)制原核生物DNA聚合酶的比較

DNA聚合酶有6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)模板DNA結(jié)合位點(diǎn)引物結(jié)合位點(diǎn)引物3，-OH位點(diǎn)、反應(yīng)位點(diǎn)底物dNTP結(jié)合位點(diǎn)5，→3，

外切位點(diǎn)(pol.Ⅱ沒(méi)有)3，→5，

外切位點(diǎn)(校正)真核DNA聚合酶一般不具備外切活力，可能由另外的酶在DNA復(fù)制中起校正功能。

⑴DNA聚合酶α，多亞基，功能與E.coli.pol.Ⅲ類(lèi)似，是真核DNA復(fù)制酶。

⑵DNA聚合酶β，主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。

⑶DNA聚合酶γ，從線粒體得到，可能與線粒體DNA的復(fù)制有關(guān)。

⑷DNA聚合酶δ，特點(diǎn)：有3，→5，外切活力。

真核生物DNA聚合酶真核生物DNA聚合酶的比較βγδε亞基數(shù)44425分子量（KD)＞25036-38160-300170256細(xì)胞內(nèi)定位核核線粒體核核5′→3′聚合活性＋＋＋＋＋3′→5′外切活性－－＋＋＋

功能復(fù)制、引發(fā)修復(fù)復(fù)制復(fù)制修復(fù)α1.3.2原核細(xì)胞DNA的復(fù)制岡崎片斷和半不連續(xù)復(fù)制按照Watson-Crick假說(shuō)DNA兩條鏈的方向相反如果DNA的一條鏈從5—3合成，則另一條鏈必須從3---5延伸。1968年岡崎等人用3H脫氧胸苷摻入噬菌體感染的大腸桿菌發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)先合成的是較短的DNA片斷接著出現(xiàn)大分子新DNA的一條鏈?zhǔn)前?—3方向合成的，稱(chēng)為“前導(dǎo)鏈”該片段的合成是連續(xù)的。另一條鏈的合成是不連續(xù)的先合成若干片斷再通過(guò)酶的作用形成第二條新鏈，稱(chēng)為“后隨鏈”岡崎片段長(zhǎng)度：

細(xì)菌：1Kb-2Kb，相當(dāng)于一個(gè)順?lè)醋拥拇笮　?/p>

真核：100-200bp，約等于一個(gè)核小體DNA的長(zhǎng)度。

岡崎片斷和半不連續(xù)復(fù)制

DNA復(fù)制過(guò)程（E.coli.）

1、

復(fù)制的起始引發(fā)：當(dāng)DNA的雙螺旋解開(kāi)后，合成RNA引物的過(guò)程。

引發(fā)體：引物合成酶與各種蛋白質(zhì)因子（dnaB、dnaC、n、n＇n＇＇I）構(gòu)成的復(fù)合體，負(fù)責(zé)RNA引物的合成。

引發(fā)體沿著模板鏈5’→3’方向移動(dòng)（與岡崎片段合成的方向正好相反，而與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同），移到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。

E.coli.DNA復(fù)制原點(diǎn)oriC，由245bp組成，三組13bp重復(fù)序列（近5，端處），四組9bp重復(fù)序列（另一端處）。大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)起始復(fù)制所需蛋白質(zhì)

DNaA

在原點(diǎn)處打開(kāi)雙螺旋

DNaB

使DNA解旋

DNaCDNaB結(jié)合在原點(diǎn)所需

Hu

刺激起始引物酶（DNaG）

合成RNA引物

SSB結(jié)合單鏈DNARNA聚合酶

促進(jìn)DNaA活性旋轉(zhuǎn)酶

松馳DNA扭曲應(yīng)力20個(gè)DnaA結(jié)合在四組9bp重復(fù)區(qū)，形成起始復(fù)合物，DNA環(huán)繞此復(fù)合物。三組13bp重復(fù)區(qū)依次變性，產(chǎn)生開(kāi)放型復(fù)合物。

DnaB（在DnaC協(xié)助下）與開(kāi)放復(fù)合物結(jié)合，進(jìn)一步解鏈。

大腸桿菌復(fù)制原點(diǎn)起始復(fù)制所需蛋白質(zhì)2、

DNA鏈的延長(zhǎng)反應(yīng)

前導(dǎo)鏈只需要一個(gè)RNA引物，后隨鏈的每一個(gè)岡崎片段都需要一個(gè)RNA引物，鏈的延長(zhǎng)反應(yīng)由DNApol.Ⅲ催化。

復(fù)制體：在DNA合成的生長(zhǎng)點(diǎn)（既復(fù)制叉上）分布著許多與復(fù)制有關(guān)的酶和輔助因子，它們?cè)贒NA的模板鏈形成離散的復(fù)合物，彼此配合進(jìn)行高度精確的復(fù)制，稱(chēng)為復(fù)制體。

復(fù)制體沿著復(fù)制叉方向前進(jìn)就合成DNA。

3、

RNA引物的切除及缺口補(bǔ)齊DNApolⅠ的5，→3，外切活力，切除RNA引物。

DNApolⅠ的5，→3，合成活性補(bǔ)齊缺口。

4、

DNA切口的連接DNAligase，動(dòng)物、真核由ATP供能，原核由NAD供能。催化一條DNA鏈的3′末端與相鄰的另一條DNA鏈的5′末端之間的磷酸二酯鍵的合成。其它功能：（1）修補(bǔ)雙螺旋DNA中單股的缺口；（2）連接線狀雙螺旋DNA以產(chǎn)生環(huán)狀DNA；（3）重組過(guò)程中將幾段DNA鏈連接起來(lái)。母本DNA雙鏈的分離原核細(xì)胞DNA的復(fù)制聚合酶的校對(duì)作用參見(jiàn)課本P252圖12-9復(fù)制的準(zhǔn)確性高于轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過(guò)程。大腸桿菌DNA修復(fù)體系5、

DNA合成的終止環(huán)狀DNA、線性DNA，復(fù)制叉相遇即終止。

小結(jié)(E.coliDNA復(fù)制)⑴DNA解螺旋酶解開(kāi)雙鏈DNA。

⑵SSB結(jié)合于DNA單鏈。

⑶DNA旋轉(zhuǎn)酶引入負(fù)超螺旋，消除復(fù)制叉前進(jìn)時(shí)帶來(lái)的扭曲張力。

⑷DNA引物酶(在引發(fā)體中)合成RNA引物。

⑸DNApol.Ⅲ在兩條新生鏈上合成DNA。

⑹DNApolⅠ切除RNA引物，并補(bǔ)上DNA。

⑺DNAligase連接一個(gè)岡崎片段。

DNA復(fù)制過(guò)程中，聚合酶對(duì)dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP摻入DNA鏈中，此時(shí)，U-糖苷酶、AP內(nèi)切酶、DNApolⅠ、DNAligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正確的堿基。1.4真核生物DNA的復(fù)制1、

復(fù)制起點(diǎn)和單位2、

復(fù)制過(guò)程中組蛋白的裝配1、

復(fù)制起點(diǎn)和單位

真核生物染色體DNA是多復(fù)制子，有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可以多點(diǎn)起始，分段進(jìn)行復(fù)制。每個(gè)復(fù)制子大多在100-200bp之間，比細(xì)菌染色體DNA（單復(fù)制子）小得多。

★試驗(yàn)證據(jù)：5-氟脫氧胞苷標(biāo)記

真核生物DNA復(fù)制叉移動(dòng)的速度此原核的慢，如哺乳動(dòng)物復(fù)制叉移動(dòng)的速度每分鐘1-3Kb，細(xì)菌每分鐘5Kb。

真核生物染色體全部復(fù)制完成前，起點(diǎn)不再?gòu)男麻_(kāi)始復(fù)制。而在快速生長(zhǎng)的原核生物中，起點(diǎn)可以連續(xù)發(fā)動(dòng)復(fù)制。真核生物在快速生長(zhǎng)時(shí)，可采用更多的復(fù)制起點(diǎn)同時(shí)復(fù)制。如黑腹果蠅，早期胚胎細(xì)胞中相鄰復(fù)制起點(diǎn)的平均距離為7.9kb，而在培養(yǎng)的成體細(xì)胞中，平均距離為40kb，成體細(xì)胞只利用一部分復(fù)制起點(diǎn)。

DNA復(fù)制時(shí)復(fù)制叉的組成2、

復(fù)制過(guò)程中組蛋白的裝配核小體的結(jié)構(gòu)（200bp左右）

在真核生物的復(fù)制子上，親代染色體的核小體被逐個(gè)打開(kāi)，組蛋白以完整的八聚體形式直接轉(zhuǎn)移到子代DNA的前導(dǎo)鏈上，新合成的組蛋白與后隨鏈組裝成核小體。因此，DNA的復(fù)制是半保留的，而組蛋白則是全保留的。

★試驗(yàn)證據(jù)：環(huán)己酮亞胺抑制組蛋白合成，電子顯微鏡下觀察1.5反轉(zhuǎn)錄作用反轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，以RNA為模板，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3′OH末端上，按5′→3′方向，合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA(complementaryDNA,cDNA)，它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成過(guò)程大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性:①DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過(guò)程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉(zhuǎn)錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒(méi)有校正功能，所以由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高。②RNaseH活性；由反轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。除此之外，有些反轉(zhuǎn)錄酶還有DNA內(nèi)切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中有關(guān)。反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于遺傳工程技術(shù)起了很大的推動(dòng)作用，目前它已成為一種重要的工具酶。用組織細(xì)胞提取mRNA并以它為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成出互補(bǔ)的DNA(cDNA)，由此可構(gòu)建出cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)，從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術(shù)中最常用的獲得目的基因的方法。關(guān)于反轉(zhuǎn)錄酶的幾點(diǎn)說(shuō)明1.6DNA的損傷與修復(fù)錯(cuò)配修復(fù)（mismatchRepair）

錯(cuò)配修復(fù)對(duì)DNA復(fù)制忠實(shí)性的貢獻(xiàn)力達(dá)102-103，DNA子鏈中的錯(cuò)配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性堿基切除修復(fù)（Base-ExcisionRepair）

DNAgylcosylases能特異性識(shí)別常見(jiàn)的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化產(chǎn)物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱(chēng)為AP位點(diǎn)（apurinicor

apyrimidinic）。細(xì)胞中最常見(jiàn)的UracilGlycosylase就能特異性切除細(xì)胞中的去氨基胞嘧啶。核苷酸切除修復(fù)（nucleotide-excisionrepair）

當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無(wú)法形成氫鍵，由核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)負(fù)責(zé)進(jìn)行修復(fù)DNA的直接修復(fù)（Directrepair）

SOS修復(fù)系統(tǒng)1.7細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)(1)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的序列具有二次旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)性。限制性核酸內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生平頭末端或粘性末端。5′—G—T—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—T—G—5′5′—G—T—TA—A—C—3′3′—C—A—AT—T—G—5′平頭末端HpaⅠ5′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—A—G—5′5′—GA—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—AG—5′粘性末端EcoRⅠ細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)(2)細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)1.8基因重組與DNA克隆1.9

PCR技術(shù)與DNA擴(kuò)增1985年A.K.Saiki等首先報(bào)道了PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）5′5′1熱變性2退火5′5′5′5′3DNA聚合酶5′5′5′5′重復(fù)1，2，3PCR反應(yīng)全過(guò)程

PCR技術(shù)二RNA的生物合成RNA的生物合成包括轉(zhuǎn)錄和RNA的復(fù)制。

轉(zhuǎn)錄（transcription）：以一段DNA的遺傳信息為模板，在RNA聚合酶作用下，合成出對(duì)應(yīng)的RNA的過(guò)程，或在DNA指導(dǎo)下合成RNA。

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：mRNA

、rRNA、tRNA、小RNA

除某些病毒基因組RNA外，絕大多數(shù)RNA分子都來(lái)自DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。

2.1轉(zhuǎn)錄研究的主要問(wèn)題

①RNA聚合酶②轉(zhuǎn)錄過(guò)程③轉(zhuǎn)錄后加工④轉(zhuǎn)錄的調(diào)控

①~③是基本內(nèi)容，④是目前研究的焦點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因調(diào)控的核心。

轉(zhuǎn)錄與DNA復(fù)制的異同

相同：要有模板，新鏈延伸方向5’→3’，堿基的加入嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則。

相異：①?gòu)?fù)制需要引物，轉(zhuǎn)錄不需引物。

②轉(zhuǎn)錄時(shí)，模板DNA的信息全保留，復(fù)制時(shí)模板信息是半保留。

③轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶只有5’→3’聚合作用，無(wú)5’→3’及3’→5’外切活性。