基因功能研究技術(shù)

第六章分子生物學(xué)研究法〔下〕基因功能研究技術(shù)隨著越來越多的基因組序列相繼被測(cè)定，人類對(duì)生物本質(zhì)的認(rèn)識(shí)已經(jīng)發(fā)生了重大變化。但是，海量序列信息也向我們提出了新的挑戰(zhàn)。如何開發(fā)利用這些序列信息，如何通過生物化學(xué)、分子生物學(xué)等方法研究基因的功能，從而進(jìn)一步了解生物體內(nèi)各種生理過程，了解生物體生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制，了解疾病的發(fā)生、開展規(guī)律，給出控制、減緩甚至完全消除人類遺傳疾病，是新時(shí)期生物學(xué)家所面臨的主要問題。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)、原位雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)為研究單個(gè)或多個(gè)基因在生物體某些特定發(fā)育階段或在不同環(huán)境條件下的表達(dá)模式提供了強(qiáng)有力的手段。用基因定點(diǎn)突變〔site-directedmutagenesis〕技術(shù)、基因敲除技術(shù)、RNAi技術(shù)可以全部或局部抑制基因的表達(dá)，通過觀察靶基因缺失后生物體的表型變化研究基因功能。酵母單雜交、雙雜交技術(shù)，四分體技術(shù)等都是研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-DNA相互作用等的重要手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的開展，研究者可以在活細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，為認(rèn)識(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工等提供了豐富的技術(shù)支持。本章將主要介紹研究基因功能的各種分子生物學(xué)技術(shù)和方法。6.1基因表達(dá)研究技術(shù)6.1.轉(zhuǎn)錄組分析和RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組〔transcriptome〕，廣義上指在某一特定生理?xiàng)l件或環(huán)境下，一個(gè)細(xì)胞、組織或者生物體中所有RNA的總和，包括信使RNA〔mRNA〕、核糖體RNA〔rRNA〕、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA〔tRNA〕及非編碼RNA〔non-codingRNA或sRNA〕；狹義上特指細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA的總和?；蚪M－轉(zhuǎn)錄組－蛋白質(zhì)組〔genome－transcriptome－proteome〕是中心法那么在組學(xué)框架下的主要表現(xiàn)形式。通過特定生理?xiàng)l件下細(xì)胞內(nèi)的mRNA豐度來描述基因表達(dá)水平并外推到最終蛋白質(zhì)產(chǎn)物的豐度是目前基因表達(dá)研究的根本思路。轉(zhuǎn)錄組研究的根本方法包括基因芯片技術(shù)〔genechip〕和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)。我們將在節(jié)詳細(xì)表達(dá)基因芯片技術(shù)，這里主要討論轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的原理和應(yīng)用?；趥鹘y(tǒng)的Sanger測(cè)序法對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行研究的方法主要包括：表達(dá)序列標(biāo)簽〔expressedsequencetag，EST〕測(cè)序技術(shù)，基因表達(dá)系列分析技術(shù)〔serialanalysisofexpression，SAGE〕。EST測(cè)序數(shù)據(jù)是目前數(shù)量最多，涉及物種最廣的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，但測(cè)序讀長(zhǎng)較短〔每個(gè)轉(zhuǎn)錄本測(cè)定400bp－500bp〕，測(cè)序通量小，測(cè)序本錢較高，而且無法通過測(cè)序同時(shí)得到基因表達(dá)豐度的信息。有人使用SAGE測(cè)序法，將不同轉(zhuǎn)錄本3’端第一個(gè)CATG位點(diǎn)下游14bp長(zhǎng)的短標(biāo)簽序列來標(biāo)識(shí)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本。由于標(biāo)簽序列較短，可以將多個(gè)標(biāo)簽串聯(lián)測(cè)序，使SAGE法相對(duì)于EST測(cè)序在通量上大大提高。但過短的序列標(biāo)簽使得序列唯一性降低，即使改良過的LongSAGE用21bp標(biāo)簽測(cè)序，仍然有約一半的標(biāo)簽無法被準(zhǔn)確注釋到基因組上。高通量測(cè)序技術(shù)〔high-throughputsequencing〕，又名二代測(cè)序〔second-generationsequencing〕或深度測(cè)序〔deepsequencing〕，可以一次性測(cè)序幾十萬甚至幾百萬條序列，是傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)的一次革命。主要有Roche公司研發(fā)的454測(cè)序平臺(tái)和Illumina公司的Solexa測(cè)序平臺(tái)〔表6-1〕。表6-1454和Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)比擬454Illumina讀取長(zhǎng)度〔bp〕約70050－150單次測(cè)序數(shù)據(jù)量700Mb600Gb測(cè)序周期23小時(shí)7－14天測(cè)序本錢較高低雖然都是基于“邊合成邊測(cè)序〔sequencingbysynthesis，SBS〕〞，但是454和Illumina的實(shí)現(xiàn)方法有很大的不同。454系統(tǒng)采用焦磷酸測(cè)序〔pyrosequencing〕原理，如圖6-1a所示，在DNA聚合酶的作用下，按照T、A、C、G順序參加的單個(gè)dNTP與模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，同時(shí)釋放一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)，在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和腺苷酰硫酸〔adenosine-5’-phosphosulfate,APS〕結(jié)合形成ATP，在螢光素酶的催化下，ATP和螢光素結(jié)合形成氧化螢光素，產(chǎn)生可見光，被CCD捕捉。而Illumina系統(tǒng)〔圖6-1b〕采用帶有螢光標(biāo)記的dNTP，其3’羥基末端帶有可被化學(xué)切割的局部，每個(gè)循環(huán)反響只允許摻入一個(gè)堿基，由激光掃描反響板外表，讀出這一輪反響新加的螢光信號(hào)，從而判定堿基種類。之后，經(jīng)過化學(xué)切割恢復(fù)3’端粘性，進(jìn)行下一輪聚合反響。從上述描述中不難看出，隨著反響的進(jìn)行，已有螢光信號(hào)會(huì)使新的熒光難以準(zhǔn)確分辨，因此該方法的測(cè)序讀長(zhǎng)較短，測(cè)序錯(cuò)誤主要是堿基替換。而454那么由于缺少終止反響的元件，相同堿基的連續(xù)摻入常會(huì)帶來利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)測(cè)序得到的大量原始讀長(zhǎng)〔reads〕進(jìn)行過濾、組裝及生物信息學(xué)分析的過程被稱為RNA-Seq。對(duì)于有參考基因組序列的物種，需要根據(jù)參考序列進(jìn)行組裝〔referenceassembly〕，對(duì)于沒有參考序列的，需要進(jìn)行從頭組裝〔denovoassembly〕，利用大量讀長(zhǎng)之間重疊覆蓋和成對(duì)讀長(zhǎng)〔pair-endreads〕的相對(duì)位置關(guān)系，組裝得到盡可能完整的轉(zhuǎn)錄本，并以單位長(zhǎng)度轉(zhuǎn)錄本上覆蓋的讀長(zhǎng)數(shù)目〔readsperkilo-basegenepermillionbases，RPKM〕作為衡量基因表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)〔圖6-2〕。在實(shí)際組裝過程中，圖中紅色標(biāo)示區(qū)域覆蓋度過低，且讀長(zhǎng)缺乏相對(duì)位置信息的區(qū)域，其可信度較低，應(yīng)當(dāng)剔除，保存兩側(cè)序列?，F(xiàn)以棉花轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)為例，簡(jiǎn)單分析不同組織或纖維不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)情況〔表6-2〕。Illumina平臺(tái)測(cè)序得到26.86Gb數(shù)據(jù)，經(jīng)過從頭組裝總共獲得了42,773條非重復(fù)序列，平均長(zhǎng)度1,054堿基。每個(gè)不同組織中分別有23,265至26,427個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄本。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不但能用來分析不同組織中獨(dú)立轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，還被用于分析特定轉(zhuǎn)錄本在某個(gè)組織中的表達(dá)強(qiáng)度〔表6-3〕。RNA-Seq還可以用于轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄本SNP檢測(cè)、非編碼區(qū)功能鑒定以及挖掘低豐度轉(zhuǎn)錄本等研究。表6-2陸地棉6個(gè)組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析組織樣品讀長(zhǎng)數(shù)堿基數(shù)Q201(%)N50獨(dú)立基因總數(shù)獨(dú)立基因長(zhǎng)度(nt)開花后0天胚珠47907298359304735082726427778開花后5天胚珠53022210397666575084223520786花48049786360373395082323265775葉54191238406434285082025280776根79438254714944286078623905753莖49713024447417216078224088746總計(jì)3323218102686140492013064277310541Q20，測(cè)序準(zhǔn)確率到達(dá)99％。表6-3棉花組織特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)強(qiáng)度分析序列標(biāo)識(shí)基因RPKM序列標(biāo)識(shí)基因RPKM根莖根莖Unigene58528MYB-LUnigene85367FAR10.4065.51Unigene58563B3Unigene29146HD-ZIP0.0044.49Unigene58582B3Unigene51008HB0.2443.60Unigene58458DofUnigene18073MIKC0.1336.74Unigene55872DofUnigene64521MYB0.1531.71Unigene51911bHLHUnigene58698B30.0924.01Unigene58446NACUnigene62109MYB0.0418.45Unigene57837bHLHUnigene52681bZIP0.2017.62Unigene58640S1Fa-LUnigene64531G2-L0.3416.92Unigene55579B3Unigene64486bHLH0.0014.49轉(zhuǎn)錄組組裝過程中，同一個(gè)非重復(fù)序列上復(fù)蓋有來自根、莖等不同組織的讀長(zhǎng)，不同讀長(zhǎng)數(shù)目通過歸一化轉(zhuǎn)變?yōu)镽PKM值，進(jìn)而篩選得到組織特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。6.1.2RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式〔選擇不同的剪接位點(diǎn)組合〕從一個(gè)mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程。一般將選擇性剪切分為如下幾類：平衡剪切、5’選擇性剪切、36.原位雜交(InSituHybridization，ISH)是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段，通常分為RNA原位雜交和染色體原位雜交兩大類。RNA原位雜交用放射性或非放射性〔如地高辛、生物素等〕標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反響，假設(shè)細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，就可通過檢測(cè)放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞水平上做出定性定量分析〔圖6-6〕。熒光原位雜交〔fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH〕技術(shù)首先對(duì)寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置〔圖6-7〕。FISH技術(shù)不需要放射性同位素，實(shí)驗(yàn)周期短，檢測(cè)靈敏度高，假設(shè)用經(jīng)過不同修飾的核苷酸分子標(biāo)記不同的DNA探針，還可能在同一張切片上觀察幾種DNA探針的定位，得到相應(yīng)位置和排列順序的綜合信息。6.1.定點(diǎn)突變是重組DNA進(jìn)化的根底，該方法通過改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，常用于研究某個(gè)〔些〕氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列，修飾表達(dá)載體，引入新的酶切位點(diǎn)等。由于迄今尚未建立能精確預(yù)測(cè)特定氨基酸殘基變化對(duì)整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)及活性影響的模型，選擇氨基酸突變的位點(diǎn)存在一定的盲目性。因?yàn)榧词怪懒嗽摰鞍椎娜S結(jié)構(gòu)，人們?nèi)匀粺o法了解某個(gè)氨基酸殘基對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。少數(shù)幾個(gè)氨基酸殘基的改變，有時(shí)根本不影響靶蛋白的功能，有時(shí)影響了靶蛋白的活性位點(diǎn)，有時(shí)還能從根本上改變整個(gè)蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)。所以，基因的定點(diǎn)突變是我們進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的重要手段。最早在20世紀(jì)70年代初進(jìn)行小噬菌體ΦX174單鏈基因組易突變位點(diǎn)圖譜分析工作時(shí)認(rèn)識(shí)到基因定點(diǎn)突變的可能性。在人工成功合成寡聚核苷酸、獲得高品質(zhì)DNA聚合酶和DNA連接酶的根底上，科學(xué)家建立了體外寡核苷酸介導(dǎo)的DNA突變技術(shù)〔圖6-8〕。PCR技術(shù)的出現(xiàn)大大促進(jìn)了定點(diǎn)突變技術(shù)的開展，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作程序，提高了突變效率?？茖W(xué)家主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法，在基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變。圖6-9闡述了重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變機(jī)制。首先將模板DNA分別與引物對(duì)1〔正向誘變引物FM和反向引物R2〕和2〔正向引物F2和反向誘變引物RM〕退火，通過PCR1和2反響擴(kuò)增出兩種靶基因片段。FMR2和RMF2片段在重疊區(qū)發(fā)生退火，用DNA聚合酶補(bǔ)平缺口，形成全長(zhǎng)雙鏈DNA，進(jìn)行PCR3擴(kuò)增。最后，用引物F2和R2擴(kuò)增出帶有突變位點(diǎn)的全長(zhǎng)DNA片段〔PCR4〕。大引物誘變法首先用正向突變引物〔M〕和反向引物〔R1〕，擴(kuò)增模板DNA產(chǎn)生雙鏈大引物〔PCR1〕，與野生型DNA分子混合后退火并使之復(fù)性，第二輪PCR中參加正向引物〔F2〕，與PCR1中產(chǎn)生的一條互補(bǔ)鏈配對(duì)，擴(kuò)增產(chǎn)生帶有突變的雙鏈DNA〔圖6-10〕。由于F2的退火溫度顯著高于第一輪PCR所使用的引物M和R1，因此，可以忽略引物M和R1在本輪反響中所造成的干擾。獲得定點(diǎn)突變PCR產(chǎn)物以后，一般需進(jìn)行DNA序列分析以驗(yàn)證突變位點(diǎn)。與經(jīng)典定點(diǎn)突變方法相比，PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)：1、突變體回收率高，以至于有時(shí)不需要進(jìn)行突變體篩選；2、能用雙鏈DNA作為模板，可以在任何位點(diǎn)引入突變；3、可在同一試管中完成所有反響；4、快速簡(jiǎn)便，無需在噬菌體M13載體上進(jìn)行分子克隆。所以，PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法已成為定點(diǎn)突變的主要技術(shù)。6.2基因敲除技術(shù)6.2.1根本原理經(jīng)典遺傳學(xué)〔Forwardgenetics〕是從一個(gè)突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列。在后基因組時(shí)代，大規(guī)模基因功能的研究正成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)代遺傳學(xué)〔Reversegenetics，反向遺傳學(xué)〕首先從基因序列出發(fā)，推測(cè)其表現(xiàn)型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能。基因敲除〔geneknock-out〕又稱基因打靶，該技術(shù)通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。1985年，科學(xué)家利用同源重組將一段外源質(zhì)粒p△β117插入到人類染色體DNAβ-珠蛋白位點(diǎn)，首次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因打靶并獲得成功。目前，在胚胎干細(xì)胞中進(jìn)行同源重組已經(jīng)成為遺傳修飾基因組位點(diǎn)的常規(guī)技術(shù)。通過對(duì)這些基因敲除生物個(gè)體的表型分析，鑒定或推測(cè)該基因的生物學(xué)功能。基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除〔又稱不完全基因敲除〕兩種。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性，條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細(xì)胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。1．完全基因敲除實(shí)驗(yàn)中一般采用取代型或插入型載體〔圖6-11〕在ES細(xì)胞中根據(jù)正-負(fù)雙向選擇〔positive-negativeselection,PNS〕原理〔圖6-12〕進(jìn)行完全基因敲除實(shí)驗(yàn)。正向選擇基因neo通常被插入載體靶DNA功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過同源重組法置換靶基因的功能區(qū)。neo基因有雙重作用，一方面形成靶位點(diǎn)的插入突變，同時(shí)可作為正向篩選標(biāo)記。負(fù)向選擇基因HSV-tk〔humansemianvirus-thymidinekinase〕那么被置于目的片段外側(cè)，含有該基因的重組細(xì)胞不能在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。如果細(xì)胞中發(fā)生了隨機(jī)重組，負(fù)向選擇基因就可能被整合到基因組中，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于基因轉(zhuǎn)移的同源重組自然發(fā)生率極低，動(dòng)物的重組概率約為10-2～10-5，植物的概率為10-4～10-5，即使采用雙向選擇法也很難保證一次就從眾多細(xì)胞中篩選出真正發(fā)生了同源重組的胚胎干細(xì)胞，必須用PCR及Southern雜交等多種分子篩選技術(shù)驗(yàn)證確實(shí)獲得了目的基因被敲除的細(xì)胞系。2．條件型基因敲除對(duì)于許多有重要生理功能的基因來說，完全基因敲除往往導(dǎo)致胚胎死亡，有關(guān)該基因功能的研究便無法開展。而條件型基因敲除，特別是應(yīng)用Cre/LoxP和FLP/FRT系統(tǒng)所開展的組織特異性敲除，由于其可調(diào)節(jié)性而受到科學(xué)家的重視。構(gòu)建條件型基因敲除打靶載體時(shí)，常將正向選擇標(biāo)記neor置于靶基因的內(nèi)含子中，并在靶基因重要功能域兩側(cè)內(nèi)含子中插入方向相同的LoxP位點(diǎn)〔圖6-13〕。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中需要消除靶基因活性時(shí)，與帶有Cre重組酶基因的ES細(xì)胞雜交，Cre重組酶就能把兩個(gè)LoxP位點(diǎn)中間的DNA片段切除，導(dǎo)致靶基因失活。標(biāo)記基因兩側(cè)也常常帶有LoxP序列，因?yàn)樵S多時(shí)候即使標(biāo)記基因位于內(nèi)含子中也會(huì)阻斷靶基因的轉(zhuǎn)錄。一旦出現(xiàn)這種情況，可以用Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶ES細(xì)胞，通過LoxP位點(diǎn)重組將neo抗性基因刪除。以Cre/loxp系統(tǒng)為根底，可以在動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因進(jìn)行遺傳修飾。利用控制Cre表達(dá)的啟動(dòng)子活性或所表達(dá)的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)性的特征，人們常常通過設(shè)定誘導(dǎo)時(shí)間的方法對(duì)動(dòng)物基因突變的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制，以防止出現(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。6.2.2高等動(dòng)物基因敲除技術(shù)胚胎干細(xì)胞〔ES細(xì)胞〕別離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動(dòng)物基因敲除的技術(shù)根底。真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)局部發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)，主要實(shí)驗(yàn)流程及篩選步驟如圖6-14所示。利用Neo基因替換目的基因外顯子IV至外顯子VI區(qū)段，得到腸堿性磷酸酶〔IntestinalAlkalinePhosphatase，IAP〕基因敲除的ES細(xì)胞，用顯微注射或電穿孔法將IAP基因敲除的ES細(xì)胞注入早期胚胎的囊胚腔中，誘導(dǎo)胚胎分化，獲得嵌合體胚胎后與野生型純合體胚胎回交，獲得由ES細(xì)胞分化產(chǎn)生的IAP基因敲除小鼠，實(shí)驗(yàn)證明，純合小鼠體內(nèi)檢測(cè)不到IAP蛋白，而該基因的敲除導(dǎo)致小鼠變胖〔圖6-15〕。在條件型基因敲除實(shí)驗(yàn)中，首先構(gòu)建帶有S6基因的LoxP打靶載體的ES細(xì)胞，經(jīng)過雜交篩選，獲得純合體小鼠；再與帶有肝組織特異性、受INF-α誘導(dǎo)的Mx-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，刪除neo和外顯子3-5，得到肝組織特異性敲除S6基因小鼠后發(fā)現(xiàn)，［3H］胸腺嘧啶不能摻入S6基因敲除小鼠肝組織，細(xì)胞不能進(jìn)入S期，不能正常分裂增殖〔圖6-16〕。一般來說，動(dòng)物基因敲除時(shí)用顯微注射胚胎干細(xì)胞命中率較高，技術(shù)難度相對(duì)大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，但操作相對(duì)簡(jiǎn)單易行。因?yàn)橥粗亟M常常發(fā)生在某一條染色體上,要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，至少需要兩代以上的遺傳。除了基因敲除法，還有人用基因捕獲的方法通過隨機(jī)插入突變破壞靶基因表達(dá)〔圖6-17〕?；虿东@載體包括一個(gè)無啟動(dòng)子的報(bào)告基因〔通常為neor基因〕，當(dāng)該基因插入到ES細(xì)胞染色體某個(gè)部位，利用所在位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件得到表達(dá)時(shí)，該ES細(xì)胞就獲得在含G418的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力?？赏ㄟ^分析標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體DNA序列來獲得靶基因的相關(guān)信息。由于受整合位點(diǎn)附近染色質(zhì)區(qū)的影響，轉(zhuǎn)基因整合具有顯著的位置效應(yīng)，基因5’端啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)，3’端終止子區(qū)都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因的整合產(chǎn)生影響，這是某些打靶載體選擇組織特異性啟動(dòng)子的原因之一。外源轉(zhuǎn)基因的有效表達(dá)有時(shí)還取決于其是否有內(nèi)含子，因?yàn)閮?nèi)含子中存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可影響除了研究基因功能之外，基因敲除技術(shù)還被廣泛應(yīng)用于建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為遺傳病的治療、為生物新品種的培育奠定新根底。6.2.3植物基因敲除技術(shù)由于動(dòng)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯著不相同，植物細(xì)胞基因敲除常采用不同于動(dòng)物細(xì)胞的策略。T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。T-DNA插入失活就是利用根瘤農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將一段帶有報(bào)告基因的DNA序列標(biāo)簽整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會(huì)影響該基因的表達(dá)，從而使該基因“失活〞。由于該基因內(nèi)部或附近插入了一段序列的DNA，可據(jù)此設(shè)計(jì)引物，用PCR方法將被破壞的靶基因序列別離出來〔圖6-18A〕。假設(shè)將靶基因〔假定編碼區(qū)為900個(gè)堿基對(duì)〕兩端的引物L(fēng)P、RP及插入載體上的引物L(fēng)B參加同一反響體系中進(jìn)行PCR，理論上能得到三種類型的條帶〔圖6-18B〕。野生型植株中，只有LP和RP引物配對(duì)擴(kuò)增出來的靶基因條帶；如果實(shí)驗(yàn)材料來自純合型基因敲除植株，那么，只有靶基因一端的引物可以與LB引物配對(duì)完成PCR擴(kuò)增；如果實(shí)驗(yàn)材料來自雜合型基因敲除植株，那么，PCR擴(kuò)增后會(huì)同時(shí)出現(xiàn)兩種條帶。T-DNA無專一整合位點(diǎn)，在植物基因組中發(fā)生隨機(jī)整合，所以，只要突變株的數(shù)目足夠大，從理論上就可能獲得任何一個(gè)功能基因都發(fā)生突變的基因敲除植物庫(kù)。擬南芥基因組冗余序列少，基因密度高，幾乎每一個(gè)DNA插入都會(huì)導(dǎo)致某個(gè)基因功能的喪失，結(jié)合已完成的擬南芥基因組信息，人們很容易篩選到新的功能基因。已經(jīng)用T-DNA插入失活方法建立了擬南芥大規(guī)模基因敲除突變體庫(kù)，研究人員可以方便地在多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到感興趣基因的突變體，再開展深入的表型分析和功能研究。6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)6.3.1酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)〔yeastone-hybridsystem〕是上個(gè)世紀(jì)90年代中期開展起來的新技術(shù)，可識(shí)別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，可在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫(kù)直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。此外，該體系也是分析鑒定細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與順式作用元件相互作用的有效方法。酵母單雜交的根本原理如圖6-19所示，首先將的特定順式作用元件構(gòu)建到最根本啟動(dòng)子〔minimalpromoter，Pmin〕的上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游。然后，將編碼待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子cDNA與酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域〔transcriptionactivationdomain,AD〕融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活Pmin啟動(dòng)子，使報(bào)告基因得到表達(dá)。目前，酵母單雜交體系主要被用于確定某個(gè)DNA分子與某個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用，用于別離編碼結(jié)合于特定順式調(diào)控元件或其他DNA位點(diǎn)的功能蛋白編碼基因，驗(yàn)證反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，準(zhǔn)確定位參與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的核苷酸序列。由于該方法的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細(xì)胞中含量極低且用生化手段難以純化的那局部轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。常用的酵母單雜交體系根本選用HIS3或LacZ作為報(bào)告基因，雖然有的體系將帶有報(bào)告基因的載體直接整合于酵母染色體上，在大局部的實(shí)驗(yàn)中報(bào)告基因都位于質(zhì)粒DNA上。圖6-20是利用酵母單雜交體系和的順式作用元件DRE從擬南芥cDNA文庫(kù)中篩選轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的根本流程。實(shí)驗(yàn)中如果將不同的未知基因與酵母GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相融合，通過檢測(cè)位于GAL4順式作用元件下游的報(bào)告基因的表達(dá)狀況，還可以鑒定出該轉(zhuǎn)錄因子是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能。6.3.2酵母雙雜交系統(tǒng)〔Yeasttwo-hybridsystem〕該體系巧妙地利用真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式結(jié)構(gòu)〔modular〕特征，因?yàn)檫@些蛋白往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域〔bindingdomain，BD〕和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。單獨(dú)的BD能與特定基因的啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，但不能激活基因的轉(zhuǎn)錄，而由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。實(shí)驗(yàn)中，首先運(yùn)用基因重組技術(shù)把編碼蛋白的DNA序列連接到帶有酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子〔常為GAL1、GAL4或GCN1〕DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)〔BD〕的表達(dá)載體上。導(dǎo)入酵母細(xì)胞中使之表達(dá)帶有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的雜合蛋白，與報(bào)告基因上游的啟動(dòng)調(diào)控區(qū)相結(jié)合，準(zhǔn)備作為“誘餌〞捕獲與蛋白相互作用的基因產(chǎn)物。此時(shí)，假設(shè)將的編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域〔AD〕的DNA分別與待篩選的cDNA文庫(kù)中不同插入片段相連接，獲得“獵物〞載體，轉(zhuǎn)化含有“誘餌〞的酵母細(xì)胞。一旦酵母細(xì)胞中表達(dá)的“誘餌〞蛋白與“獵物〞載體中表達(dá)的某個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的AD和BD結(jié)構(gòu)域就會(huì)被牽引靠攏，激活報(bào)告基因表達(dá)。別離有報(bào)告基因活性的酵母細(xì)胞，得到所需要的“獵物〞載體，就能得到與蛋白相互作用的新基因〔圖6-21〕。6.1、等離子外表共振技術(shù)該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖外表，將葡聚糖層固定于納米級(jí)厚度的金屬膜外表。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌〞蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜外表的折射率上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用〔圖6-22〕。該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，平安靈敏快速，還可定量分析。缺點(diǎn)是需要專門的等離子外表共振檢測(cè)儀器。圖6-23應(yīng)用SPR技術(shù)研究COI1蛋白與JAZ1蛋白之間的相互作用。研究人員首先在葡聚糖芯片外表固定1000共振單位的茉莉酸〔JA〕信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子JAZ1蛋白，當(dāng)體系中同時(shí)有茉莉酸－異亮氨酸〔JA-Ile〕及COI蛋白存在時(shí)，可以檢測(cè)到最高達(dá)380共振單位的SPR反響信號(hào)。參加一種在結(jié)構(gòu)和功能上與茉莉酸甲脂〔MeJA〕非常相似的名為冠毒素(COR)的細(xì)菌毒素，也能使COI1和JAZ1發(fā)生相互作用。2、免疫共沉淀技術(shù)(Co-ImmunoPrecipitation，CoIP)該技術(shù)的核心是通過抗體來特異性識(shí)別候選蛋白。首先，將靶蛋白的抗體通過親和反響連接到固體基質(zhì)上，再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白參加反響體系中，用低離心力沉淀或微膜過濾法在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復(fù)合物沉淀到試管的底部或微膜上。如果靶蛋白質(zhì)與待篩選蛋白發(fā)生了相互作用，那么，這個(gè)待篩選蛋白質(zhì)就通過靶蛋白與抗體和固體基質(zhì)相互作用而被別離出來〔圖6-24〕。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中常用pGADT7和pGBKT7質(zhì)粒載體分別以融合蛋白形式表達(dá)靶蛋白，體外轉(zhuǎn)錄、翻譯后將產(chǎn)物混合溫育，分別用Myc或HA抗體沉淀混合物，過柱后再用SDS－PAGE電泳別離，檢測(cè)兩個(gè)靶蛋白之間是否存在相互作用〔圖6-25〕。實(shí)驗(yàn)說明，棉花乙烯合成酶基因ACS2與鈣離子依賴性蛋白激酶CDPK1之間存在相互作用，而該蛋白與CDPK32及CRK5沒有發(fā)生相互作用。ACO1與這三個(gè)蛋白都沒有發(fā)生相互作用〔圖6-26〕。3、GST及GAD融合蛋白沉降技術(shù)該技術(shù)利用GST對(duì)谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白〔圖6-27〕。GST沉降試驗(yàn)通常有兩種應(yīng)用：確定探針蛋白與未知蛋白間的相互作用，確證探針蛋白與某個(gè)蛋白之間的相互作用。與此相類似，實(shí)驗(yàn)中把GAD與PIF3的不同區(qū)段相連接成為釣餌，研究該重組蛋白在體外與光敏素B(phyB)、其缺失N-37位氨基酸的突變體或光敏素A(phyA)的相互作用情況。研究發(fā)現(xiàn)，光敏素B(phyB)能與PIF3發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用〔超過30％的光敏素B能被PIF3沉淀下來〕，但缺失N-37位氨基酸的phyB突變體以及光敏素A(phyA)只能與PIF3發(fā)生較弱的相互作用，約5％的光敏素A，或約10％的N-37位氨基酸缺失突變光敏素B能被沉淀下來〔圖6-28〕。4、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究—熒光共振能量轉(zhuǎn)移法〔FRET〕FRET現(xiàn)象是21世紀(jì)初葉發(fā)現(xiàn)的。FRET熒光能量給體與受體之間通過偶極－偶極耦合作用以非輻射方式轉(zhuǎn)移能量的過程又稱為長(zhǎng)距離能量轉(zhuǎn)移，有三個(gè)根本條件：〔1〕給體與受體在適宜的距離〔1～10nm〕；〔2〕給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊〔這是能量匹配的條件〕；〔3〕給體與受體的偶極具有一定的空間取向〔這是偶極-偶極耦合作用的條件〕。FRET需要有兩個(gè)探針，即熒光給體和熒光受體，要求給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有局部重疊，而與受體的發(fā)射光譜盡量沒有重疊。常用的探針有三種：熒光蛋白，傳統(tǒng)有機(jī)染料和鑭系染料。熒光蛋白是一類能發(fā)射熒光的天然蛋白或突變體，常見的有綠色熒光蛋白〔GFP〕、藍(lán)色熒光蛋白〔BFP〕、青色熒光蛋白〔CFP〕和黃色熒光蛋白〔YFP〕等。不同蛋白的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)不同，可根據(jù)需要組成不同的探針對(duì)。傳統(tǒng)有機(jī)染料是指一些具有特征吸收和發(fā)射光譜的有機(jī)化合物組成的染料對(duì)。常見的有熒光素、羅丹明類化合物和青色染料Cy3、Cy5等，該類染料分子體積較小，種類較多且大局部為商品化的分子探針染料，因此被廣泛應(yīng)用。鑭系染料一般與有機(jī)染料聯(lián)合使用，分別作為FRET的給體或受體，檢測(cè)的準(zhǔn)確性和信噪比擬之傳統(tǒng)染料有提高。研究蛋白質(zhì)間相互作用時(shí)，F(xiàn)RET一般與熒光成像技術(shù)聯(lián)用，將蛋白標(biāo)記上熒光探針，當(dāng)?shù)鞍组g不發(fā)生相互作用時(shí)，其相對(duì)距離較大，無FRET現(xiàn)象，而蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，其相對(duì)距離縮小，有FRET現(xiàn)象發(fā)生〔圖6-29〕，可根據(jù)成像照片的色彩變化直觀地記錄該過程。6.3.4染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)〔ChromatinImmunoPrecipitation，ChIP〕是一項(xiàng)新開展的研究活體細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，其主要實(shí)驗(yàn)流程是：在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并通過超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度的染色質(zhì)小片段，然后通過抗原抗體的特異性識(shí)別反響,沉淀該復(fù)合體，從而富集與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段，通過對(duì)目的片段的純化及PCR檢測(cè)〔圖6-30〕，獲得該蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息，包括具體的DNA序列特征，位置，結(jié)合時(shí)間、親和程度以及對(duì)基因表達(dá)的影響等〔圖6-31〕。ChIP技術(shù)不僅可以用來檢測(cè)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系，定性或定量檢測(cè)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用。如果能將你所研究的目的蛋白定位到染色質(zhì)DNA上某個(gè)或某些功能基因的啟動(dòng)子區(qū)或附近，對(duì)于確定你所感興趣的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能可能會(huì)是一次質(zhì)的飛躍。6.3.5RNAi〔RNAinterference,RNA干預(yù)〕技術(shù)及其應(yīng)用RNAi技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)線蟲注射外源雙鏈RNA〔double-strandedRNA〕可誘發(fā)與該RNA高度同源的基因序列的特異性“沉默〞。現(xiàn)在已經(jīng)知道，RNAi是一個(gè)多步驟反響過程，包括對(duì)觸發(fā)物的加工、與目標(biāo)mRNA的結(jié)合以及目標(biāo)mRNA的降解。至今已在果蠅、錐蟲、渦蟲、線蟲等許多動(dòng)物及大局部植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了RNAi效應(yīng)。雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈RNA〔ssRNA,single-strandedRNA〕的降解。經(jīng)過Dicer〔一種具有RNAaseIII活性的核酸酶〕的加工，細(xì)胞中較長(zhǎng)的外源雙鏈RNA〔30個(gè)核苷酸以上〕首先被降解形成21～25個(gè)核苷酸的小分子干擾核糖核酸〔siRNA，shortinterferingRNA〕，并有效地定位目標(biāo)mRNA。因此，siRNA是導(dǎo)致基因沉默和序列特異性RNA降解的重要中間媒介。較短的雙鏈RNA不能被有效地加工為siRNA，因而不能介導(dǎo)RNAi。siRNA具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即5’端磷酸基團(tuán)和3’端的羥基，其兩條鏈的3’端各有兩個(gè)堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈指導(dǎo)合成一種被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體〔RISC〕的核蛋白體，再由RISC介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干擾靶基因表達(dá)的功能〔圖6-32〕。siRNA還可作為特殊引物，在依賴于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA為模板合成dsRNA，后者又可被降解為新的siRNA，重新進(jìn)入上述循環(huán)。因此，即使外源siRNA的注入量較低，該信號(hào)也可能迅速被放大，導(dǎo)致全面的基因沉默。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，較長(zhǎng)的dsRNA會(huì)導(dǎo)致非特異性基因沉默，只有大約21-25個(gè)核苷酸的siRNA才能有效地引發(fā)特異性基因沉默。非哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以利用較長(zhǎng)的雙鏈RNA直接誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi而無須合成siRNA，因此，設(shè)計(jì)非哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNAi實(shí)驗(yàn)的步驟比擬簡(jiǎn)便，只要通過目的基因體外轉(zhuǎn)錄得到所需要的dsRNA，再通過浸泡、注射或轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞即可實(shí)現(xiàn)RNAi。6.4基因芯片及數(shù)據(jù)分析應(yīng)用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法如RT-PCR或Northern印跡雜交法研究基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，受電泳泳道數(shù)量的限制，每次一般只能研究很少量的靶基因。隨著功能基因組學(xué)研究的不斷深入，迫切需要能同時(shí)監(jiān)測(cè)大量靶基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)手段，以期迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律?；蛐酒睤NAchip〕，又稱DNA微陣列〔DNAmicroarray〕技術(shù)就是在這種情況下應(yīng)運(yùn)而生的。6.4.1基因芯片技術(shù)原理基因芯片是一種小型分析裝置，能夠快速和精確地研究生物體、組織、器官或細(xì)胞內(nèi)基因組的遺傳信息。制作基因芯片時(shí)，可用機(jī)械臂將大量或未知序列的DNA片段點(diǎn)在玻璃片〔通常為2×2厘米2〕、金屬片或尼龍膜上，再經(jīng)過物理吸附作用使之固定化。也可以直接在玻璃板或金屬外表進(jìn)行化學(xué)合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cDNA或其它樣品雜交，經(jīng)過計(jì)算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到成千上萬個(gè)基因在不同組織或同一組織不同發(fā)育時(shí)期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)情況〔圖6-33〕。熒光標(biāo)記的cDNA與芯片上相匹配的DNA序列發(fā)生雜交反響，使得芯片上的點(diǎn)呈現(xiàn)出熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度和基因表達(dá)的豐度成正相關(guān)。基因芯片這種微型化裝置具有巨大的容量，使科學(xué)家能在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析整個(gè)基因組的變化。用基因芯片進(jìn)行研究一般包括五個(gè)步驟：生物學(xué)問題的提出、樣品制備、生化反響、檢測(cè)、數(shù)據(jù)模型分析。6.4.2基因芯片的點(diǎn)制過程1、簡(jiǎn)易基因芯片制作簡(jiǎn)易基因芯片時(shí)，使用機(jī)械臂把DNA片段點(diǎn)在玻璃片或尼龍膜上，再經(jīng)過物理吸附作用〔85℃〕烘烤或化學(xué)處理使DNA分別固定在載體上。將芯片與待研究的cDNA或其它樣品雜交，經(jīng)過計(jì)算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時(shí)期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)調(diào)控情況〔圖6-34〕。2、大規(guī)模基因芯片大規(guī)?；蛐酒ǔＩ婕盎蚪M規(guī)模與數(shù)量〔一般大于10,000個(gè)基因〕，可采用接觸式點(diǎn)樣、非接觸式點(diǎn)樣或者半導(dǎo)體技術(shù)制備樣品。其主要工作流程如下：〔1〕經(jīng)大規(guī)模PCR擴(kuò)增獲得獨(dú)立cDNA片段；〔2〕用機(jī)械手將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在適宜的介質(zhì)上，變性、固定；〔3〕分別從不同器官、組織或細(xì)胞中別離mRNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA；〔4〕用不同的熒光染料標(biāo)記不同的cDNA樣本；〔5〕將標(biāo)記后的cDNA與點(diǎn)好的芯片進(jìn)行雜交；〔6〕激光掃描芯片雜交結(jié)果，計(jì)算機(jī)處理；〔7〕分析雜交數(shù)據(jù)。6.4.3基因芯片數(shù)據(jù)分析基因芯片數(shù)據(jù)分析包括兩局部，數(shù)據(jù)可靠性分析和生物學(xué)意義分析。數(shù)據(jù)可靠性分析。因?yàn)橛没蛐酒M(jìn)行雜交分析，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果都會(huì)有些變化，因?yàn)榘ò蠨NA濃度、探針濃度、雜交雙方的序列組成、鹽濃度以及溫度等許多因素影響了雜合雙鏈的形成和穩(wěn)定性。因此，需要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。主要的方法是通過兩次平行雜交反響，將每個(gè)基因在兩個(gè)反響中的表達(dá)水平做成對(duì)應(yīng)散點(diǎn)圖，只要絕大多數(shù)基因的雜交結(jié)果都在45度斜線附近，就說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的〔圖6-35〕。為了保證基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性，芯片中還需要加上多個(gè)持家基因〔housekeepinggenes〕作為內(nèi)對(duì)照。持家基因，如呼吸作用的酶類和細(xì)胞骨架蛋白基因等，是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育的必須基因，其表達(dá)水平在細(xì)胞內(nèi)根本不變。數(shù)據(jù)處理時(shí)，認(rèn)為持家基因的反響信號(hào)在兩種組織中不變，依此確定其它基因表達(dá)信號(hào)的相對(duì)變化。生物學(xué)意義分析。主要指通過分析芯片雜交數(shù)據(jù)，研究差異表達(dá)基因的生物學(xué)意義。通常，在芯片中某一器官或發(fā)育時(shí)期可能有成百上千個(gè)差異表達(dá)基因。例如，基因芯片分析植物根部可能有400多個(gè)特異表達(dá)的基因，如果要將這些基因的來龍去脈都搞清楚，可能要追溯超過4000篇以上的文獻(xiàn)〔假設(shè)1個(gè)基因需要查閱10篇文獻(xiàn)〕。這種不撿重點(diǎn)的方法耗時(shí)耗力，所獲得的結(jié)果也往往不一定有意義。因此，首先將差異表達(dá)基因定位于不同的生化代謝途徑，統(tǒng)計(jì)每條生化代謝途徑中固有的基因數(shù)量和被基因芯片定位的差異表達(dá)的基因數(shù)量，可以計(jì)算出特定器官或特定發(fā)育階段表達(dá)有顯著差異的代謝途徑。圖6-36是11,832個(gè)棉花cDNA的玻璃芯片雜交圖譜的差異表達(dá)基因聚類分析，發(fā)現(xiàn)有超過700個(gè)基因在棉花纖維伸長(zhǎng)期特異性高表達(dá)。將這些基因定位到不同代謝途徑中并經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，乙烯合成、細(xì)胞骨架和脂肪酸合成及延伸是三個(gè)在纖維細(xì)胞中特異性表達(dá)的代謝途徑〔表6-4〕。在后續(xù)生物學(xué)研究中，以這些最具代表性的代謝途徑為突破口，闡述了這些途徑在纖維細(xì)胞發(fā)育中的重要性。表6-4用途徑分析法研究基因芯片數(shù)據(jù)中可能具有生物學(xué)意義的代謝途徑生物體代謝途徑芯片中被定位的基因數(shù)定位的差異表達(dá)基因數(shù)P值Q值總數(shù)2914162乙烯合成53細(xì)胞骨架7510脂肪酸合成及延伸649糖胺降解164抗壞血酸代謝638油菜素內(nèi)脂合成626.5利用酵母鑒定靶基因功能釀酒酵母作為單細(xì)胞真核生物，具有和動(dòng)植物細(xì)胞相似的結(jié)構(gòu)特征，包括細(xì)胞核，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體，線粒體，過氧化物酶體，細(xì)胞骨架等，而且其細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過程和動(dòng)植物細(xì)胞也有很高的相似性，很多基因在酵母和動(dòng)植物細(xì)胞中是高度保守的。而且，酵母細(xì)胞很容易進(jìn)行生物化學(xué)和分子生物學(xué)操作，因此，酵母是基因功能研究中常用的模式生物。6.5.1酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)簡(jiǎn)介釀酒酵母〔Saccharomycescerevisiae〕有穩(wěn)定的單倍體和二倍體細(xì)胞，是最早完成基因組DNA全序列測(cè)定的真核生物。鑒于其快速生長(zhǎng)能力、無性繁殖能力以及簡(jiǎn)便的平板影印能力，它是生命科學(xué)領(lǐng)域里廣泛應(yīng)用的模式生物之一。理論上，與任何一種遺傳學(xué)特征相對(duì)應(yīng)的不同物種的結(jié)構(gòu)基因都可以通過質(zhì)粒文庫(kù)的互補(bǔ)作用而在酵母缺失突變體中得到鑒定。導(dǎo)入酵母細(xì)胞中的DNA既能以自主復(fù)制的形式存在，也可能以被整合到基因組的方式存在。酵母中轉(zhuǎn)化DNA的整合重組主要通過同源重組方式進(jìn)行，整合效率較高。酵母細(xì)胞的直徑大約有5μM,在光學(xué)顯微鏡下可以觀察它的許多重要特征。釀酒酵母細(xì)胞是以出芽方式生長(zhǎng)的。出芽的細(xì)胞被稱為母細(xì)胞，產(chǎn)生的芽就成為子細(xì)胞〔圖6-37〕。新生的芽從酵母細(xì)胞分裂周期一開始就出現(xiàn)，直到細(xì)胞周期結(jié)束才從母細(xì)胞上別離下來。由于酵母細(xì)胞的全部生長(zhǎng)都集中在芽上，而且這種生長(zhǎng)貫穿整個(gè)細(xì)胞周期，所以通過觀察芽的大小就可以粗略估計(jì)哪個(gè)細(xì)胞處于某種生長(zhǎng)發(fā)育階段。當(dāng)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素耗盡時(shí)，酵母細(xì)胞會(huì)停止生長(zhǎng)而滯留在特定生長(zhǎng)發(fā)育階段，因此，可以通過觀察顯微鏡下酵母細(xì)胞的出芽頻率確定酵母的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。酵母單倍體和二倍體細(xì)胞在形態(tài)上有相似性，但也存在重要的差異。首先，二倍體細(xì)胞的直徑大約是單倍體的1.3倍。其次，二倍體細(xì)胞呈長(zhǎng)形或卵圓形而單倍體細(xì)胞通常接近圓形。第三，二倍體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞的出芽方式不同。每個(gè)酵母細(xì)胞衰老前一般出芽20次，在母細(xì)胞外表以一定的方式連續(xù)出芽。單倍體細(xì)胞按照沿軸線的方向出芽，新芽與前一個(gè)芽緊密相連。二倍體細(xì)胞按極性方向出芽，新芽可以出現(xiàn)在長(zhǎng)形細(xì)胞的任何一端。酵母細(xì)胞有三種交配型MATa，MATα以及由這兩種細(xì)胞相互交配形成的第三種交配型MATa/α。MATa/α不能與MATa和MATα中任何一種細(xì)胞交配。一般而言，MATa和MATα為單倍體，MATa/α為二倍體，但有例外。帶有不同突變的單倍體細(xì)胞之間發(fā)生交配可以將不同的突變基因組合在同一個(gè)細(xì)胞中，為研究基因之間的相互關(guān)系提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。野生型酵母屬于原養(yǎng)型，只要培養(yǎng)基中有足夠可利用的碳源和氮源，酵母細(xì)胞就能合成自身需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。酵母首選碳源是葡萄糖，但也能利用其它很多種糖類。如果碳源適宜，酵母細(xì)胞首選通過酒精發(fā)酵產(chǎn)生能量。酵母細(xì)胞是條件性厭氧菌，在有氧和無氧狀態(tài)下都能生存。二倍體酵母細(xì)胞在低氮、無發(fā)酵性碳源的條件下〔營(yíng)養(yǎng)缺乏，“饑餓〞條件〕能通過減數(shù)分裂形成單倍體孢子。此時(shí)，每個(gè)單倍體細(xì)胞在遺傳背景上完全相同，從單個(gè)孢子來源的所有細(xì)胞都帶有一套相同的染色體DNA。這些單倍體細(xì)胞中的某些重要基因發(fā)生突變后，因?yàn)椴淮嬖诘任换?，很容易?dǎo)致酵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育異常而發(fā)生表型變化。圖6-38以酵母亮氨酸合成基因?yàn)槔榻B了二倍體細(xì)胞通過減數(shù)分裂形成單倍體細(xì)胞的過程。6.5.2酵母基因轉(zhuǎn)化與性狀互補(bǔ)利用Yip〔整合型質(zhì)?！晨梢詫?duì)酵母基因組中的任意基因進(jìn)行精確的敲除〔置換〕，并通過孢子繁殖中的四分體分析技術(shù)進(jìn)行觀測(cè)和研究。帶有致死突變位點(diǎn)和可能的外源功能互補(bǔ)基因的酵母二倍體細(xì)胞在饑餓條件下形成四分體孢子，將這四個(gè)孢子用酵母四分體別離系統(tǒng)分開，如果所引入的外源基因具備互補(bǔ)突變位點(diǎn)的功能，含有突變基因的單倍體可以存活，否那么就不能存活。圖6-39中將多個(gè)棉花KCS基因〔編碼超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成酶〕克隆到含有URA3篩選標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒上，用帶有URA3篩選標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒替換帶有TRP1篩選標(biāo)記的質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KCS12和KCS6基因都能完全互補(bǔ)野生型的表型，KCS13和KCS2雖然沒有導(dǎo)致野生型的表型，但仍能使酵母細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)，說明這些KCS基因都具備與elo2或elo3相似功能。6.5.3外源基因在酵母中的功能鑒定將外源基因克隆于酵母表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化野生型或突變酵母菌株，通過觀察酵母的表型變化或分析細(xì)胞中化學(xué)成分的變化即可推測(cè)該基因的生物學(xué)功能。例如，在酵母細(xì)胞中表達(dá)外源基因與綠色熒光蛋白基因的融合蛋白后，可通過熒光顯微鏡觀察熒光所在的亞細(xì)胞區(qū)域，從而了解該基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位。野生型酵母細(xì)胞中18碳不飽和脂肪酸主要是C18:1，這些細(xì)胞不能產(chǎn)生含有兩個(gè)或多個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸，假設(shè)將棉花中可能編碼ω-6脂肪酸脫氫酶的基因轉(zhuǎn)入野生型酵母細(xì)胞中，誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，然后用氣相色譜和質(zhì)譜技術(shù)分析細(xì)胞的脂肪酸組成，在帶有棉花基因的酵母細(xì)胞中可能出現(xiàn)C18：2不飽和脂肪酸，證明該基因編碼了有功能的ω-6脂肪酸脫氫酶〔圖6-40〕。因?yàn)榻湍讣?xì)胞中有與動(dòng)植物細(xì)胞比擬接近的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)，許多在大腸桿菌中不產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)的動(dòng)植物基因在酵母中表達(dá)后往往具有生物學(xué)功能。6.6其它分子生物學(xué)技術(shù)6.6.1凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)?zāi)z滯緩試驗(yàn)〔ElectrophoreticMobilityShiftAssay，EMSA〕，是體外分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。其根本原理是，蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合后將大大增加分子質(zhì)量，而凝膠電泳中DNA朝正電極移動(dòng)的距離與其相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成正比，因此，沒有結(jié)合蛋白的DNA片段跑得快，而與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的DNA由于受到阻滯而跑得慢。歷史上，該技術(shù)首次為大腸桿菌乳糖阻遏物與其DNA結(jié)合位點(diǎn)的相互作用提供了動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)特定的DNA片段與細(xì)胞提取物混合后，假設(shè)該復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移速率變小，就說明該DNA可能與提取物中某個(gè)蛋白質(zhì)分子發(fā)生了相互作用。這一方法簡(jiǎn)單、快捷，是別離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。在EMSA試驗(yàn)中，用放射性同位素標(biāo)記待檢測(cè)的DNA片段〔即探針DNA〕，然后與細(xì)胞提取物共溫育，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，將該復(fù)合物加到非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。通常用32P標(biāo)記DNA分子，而不標(biāo)記蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后，用放射自顯影技術(shù)顯現(xiàn)具放射性標(biāo)記的DNA條帶位置。如果細(xì)胞蛋白提取物中不存與同放射性標(biāo)記的DNA探針相結(jié)合的蛋白質(zhì)，那么所有放射性標(biāo)記都將出現(xiàn)在凝膠的底部；反之，將會(huì)形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于受到凝膠阻滯的緣故，放射性標(biāo)記的DNA條帶就會(huì)出現(xiàn)在凝膠的不同部位〔圖6-41A〕。此外，EMSA還被用于研究與蛋白質(zhì)相結(jié)合的DNA序列的特異性。在DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物中參加超量的非標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)DNA分子，如果它與標(biāo)記的探針DNA結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，由于競(jìng)爭(zhēng)DNA〔非標(biāo)記〕遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于探針DNA〔標(biāo)記〕，絕大局部蛋白質(zhì)會(huì)與競(jìng)爭(zhēng)DNA結(jié)合，探針DNA那么可能處于自由狀態(tài)，凝膠電泳的放射自顯影圖上的阻滯條帶就會(huì)顯著變?nèi)?。相反，如果?jìng)爭(zhēng)DNA不能與探針DNA所結(jié)合的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，那么，探針DNA將仍舊與其結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，阻滯條帶強(qiáng)度不發(fā)生變化。另外，通過設(shè)計(jì)一系列引入一個(gè)或數(shù)個(gè)突變堿基的放射性標(biāo)記探針，我們可以運(yùn)用EMSA來評(píng)估這些突變對(duì)探針DNA與結(jié)合蛋白相互作用的影響，進(jìn)而確定該探針DNA分子中與蛋白質(zhì)直接發(fā)生相互作用的關(guān)鍵性堿基〔圖6-41B〕。6.6.2噬菌體展示技術(shù)噬菌體是細(xì)菌病毒的總稱，英文為Bacteriophage，來源于希臘文“phagos〞，有“吞噬〞之意。噬菌體可在脫離宿主細(xì)胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但一旦脫離了宿主細(xì)胞，它們就既不能生長(zhǎng)也不能復(fù)制，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的噬菌體只能利用宿主核糖體、合成蛋白質(zhì)的因子、各種氨基酸及能量代謝體系進(jìn)行生長(zhǎng)和增殖。噬菌體可被分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型。在溶菌周期，噬菌體將其感染的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體的“制造廠〞，產(chǎn)生出大量的子代噬菌體顆粒。實(shí)驗(yàn)室常將只具有溶菌生長(zhǎng)周期的噬菌體叫作烈性噬菌體。而溶源生長(zhǎng)周期是指噬菌體DNA被整合到宿主細(xì)胞染色體DNA上，成為它的一個(gè)組成局部，感染過程中不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒。具有溶源周期的噬菌體被稱為溫和噬菌體。噬菌體展示技術(shù)是將基因表達(dá)產(chǎn)物與親和選擇相結(jié)合的技術(shù)，其根本原理是將編碼“誘餌〞蛋白〔你研究中所發(fā)現(xiàn)的任何感興趣的蛋白質(zhì)〕的DNA片段插入噬菌體基因組，并使之與噬菌體外殼蛋白編碼基因相融合。該重組噬菌體侵染宿主細(xì)菌后，復(fù)制形成大量帶有雜合外殼蛋白的噬菌體顆粒，直接用于捕獲靶蛋白庫(kù)中與“誘餌〞相互作用的蛋白質(zhì)〔圖6-42〕。噬菌體次要結(jié)構(gòu)蛋白pIII和主要結(jié)構(gòu)蛋白〔外殼蛋白〕pVIII均可作為載體來展示外源多肽。pIII基因融合時(shí)表達(dá)強(qiáng)度低(每個(gè)噬菌體上有不超過5個(gè)拷貝)，與pVIII基因融合時(shí)，表達(dá)強(qiáng)度高(每個(gè)噬菌體外殼上可能有2,700-3,000個(gè)拷貝)。在pIII和pVIII基因的信號(hào)肽與成熟蛋白質(zhì)編碼區(qū)之間都有單一的克隆位點(diǎn)便于外源基因插入，表達(dá)的融合蛋白被分泌到細(xì)胞間質(zhì)并由宿主蛋白酶切除信號(hào)肽，融合蛋白被作為結(jié)構(gòu)外殼蛋白呈現(xiàn)到病毒粒子的外表。直接法親和篩選是將靶蛋白質(zhì)分子耦聯(lián)到固相支持物上，文庫(kù)噬菌體與固相支持物溫育后洗去未結(jié)合的噬菌體，即獲得與所篩選蛋白有親和性的噬菌體。間接法親和篩選是將生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子與文庫(kù)噬菌體溫育后鋪在含有鏈親和素〔能與生物素相結(jié)合〕的平皿上，洗去未結(jié)合的噬菌體，保存在平皿上的就是結(jié)合狀態(tài)的噬菌體。洗脫結(jié)合狀態(tài)噬菌體后感染細(xì)菌，擴(kuò)增噬菌體，開始新一輪的篩選，連續(xù)幾次親和純化反響后就能選擇性富集并擴(kuò)增結(jié)合靶蛋白的噬菌體。6.6.3蛋白質(zhì)磷酸化分析技術(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、周期調(diào)控、基因表達(dá)、蛋白合成以及神經(jīng)功能、肌肉收縮等都離不開蛋白質(zhì)特異性磷酸化，因此，由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白質(zhì)可逆磷酸化過程，是生物體內(nèi)一種普遍且重要的調(diào)節(jié)方式，控制著眾多的生理生化反響和生物學(xué)過程。許多復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)還涉及到由多個(gè)蛋白激酶所催化的磷酸化級(jí)聯(lián)反響。通常蛋白激酶催化ATP或GTP的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上，促使底物蛋白發(fā)生磷酸化，而蛋白質(zhì)磷酸酯酶那么能催化底物蛋白發(fā)生去磷酸化〔圖6-43〕。此外，底物蛋白的組氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸殘基上也能發(fā)生可逆磷酸化。實(shí)驗(yàn)室研究蛋白質(zhì)磷酸化主要包括底物蛋白磷酸化和蛋白激酶活性檢測(cè)，一般采用雙向電泳及質(zhì)譜分析等檢測(cè)底物蛋白磷酸化。由于細(xì)胞內(nèi)可能有多達(dá)上千個(gè)蛋白激酶，體內(nèi)檢測(cè)某個(gè)蛋白激酶活性非常困難，科學(xué)家常用體外激酶活性分析法來檢測(cè)蛋白激酶活性。該方法能十分可靠地鑒定某個(gè)蛋白激酶對(duì)底物的磷酸化作用，篩查激酶的特異性底物。蛋白激酶體外磷酸化活性分析如圖6-44所示，主要分為獲取底物蛋白或待檢測(cè)蛋白激酶和進(jìn)行蛋白質(zhì)體外磷酸化反響兩步?？梢灾苯訌慕M織中提取目的蛋白〔包括底物蛋白及待檢測(cè)蛋白激酶〕，也可由原核或真核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。如圖6-45所示，將體外表達(dá)的棉花鈣離子依賴性蛋白激酶CDPK1與乙烯合成酶基因ACS2置于蛋白質(zhì)體外磷酸化實(shí)驗(yàn)體系中，研究發(fā)現(xiàn)，有鈣離子存在時(shí)，ACS2能被有效地磷酸化，ACO1及SUS蛋白那么不能被磷酸化。6.6.4蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)1．蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)〔Westernblotting〕。是分子生物學(xué)中最常用的蛋白質(zhì)研究技術(shù)，是二十世紀(jì)70年代末80年代初在蛋白質(zhì)凝膠電泳和固相免疫測(cè)定根底上開展起來的一種技術(shù)，為檢測(cè)樣品中是否存在蛋白抗原提供了一種可靠的方法。免疫印跡法的根本原理是被測(cè)蛋白只能與標(biāo)記的特異性抗體相結(jié)合，而這種結(jié)合不改變?cè)摰鞍自谀z電泳中的相對(duì)分子質(zhì)量。免疫印跡法具有高效、簡(jiǎn)便、靈敏等特點(diǎn)，能被用于測(cè)定抗原的相對(duì)豐度或與其它抗原的關(guān)系，也是評(píng)價(jià)新抗體特異性的一種有用方法。免疫印跡程序可分為五個(gè)步驟：1、蛋白樣品的制備；2、SDS電泳別離樣品;3、將已別離的蛋白轉(zhuǎn)移到尼龍或其它膜上，轉(zhuǎn)移后首先將膜上未反響的位點(diǎn)封閉起來以抑制抗體的非特異性吸附；4、用固定在膜上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記抗體〔一抗〕結(jié)合；5、洗去未結(jié)合的一抗，參加酶偶聯(lián)或放射性同位素標(biāo)記的二抗，通過顯色或放射自顯影法檢測(cè)凝膠中的蛋白成分〔圖5-46〕。2．抗體制備。免疫學(xué)研究中，利用抗原分子刺激機(jī)體，使其產(chǎn)生免疫學(xué)反響，由機(jī)體的漿細(xì)胞合成并分泌的能與抗原分子特異性結(jié)合的一組免疫球蛋白被定義為抗體。由于抗原分子通常是由多個(gè)抗原決定簇組成的，由單一抗原決定簇刺激機(jī)體，由一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆接受該抗原所產(chǎn)生的抗體就被稱為單克隆抗體〔monoclonalantibody〕，而由多種抗原決定簇產(chǎn)生的一組含有針對(duì)各個(gè)抗原決定簇的混合抗體，就被稱為多克隆抗體〔polyclonalantibody〕。制備技術(shù)主要分為：1、抗原準(zhǔn)備。對(duì)于某個(gè)特定的蛋白質(zhì)，常有多種抗原形式，包括形成特異性藕聯(lián)多肽、重組表達(dá)該蛋白全長(zhǎng)或局部以及重組表達(dá)的融合蛋白等。2、動(dòng)物選擇。實(shí)踐中供免疫用的動(dòng)物主要是哺乳動(dòng)物，常選擇家兔、綿羊、山羊、小鼠等。動(dòng)物選擇常依據(jù)抗體的用途和需用量決定，如需大量制備抗體，多采用體型較大的動(dòng)物。如期望獲得直接用于標(biāo)記診斷的抗體，那么應(yīng)采用與診斷目標(biāo)相同的動(dòng)物，而如需獲取間接的標(biāo)記診斷用抗體，那么必須采用異源動(dòng)物。3、動(dòng)物免疫。針對(duì)不同的動(dòng)物及要求抗體的特性等不同，需采用不同的免疫劑量、免疫周期來對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。以小鼠為例，首次的免疫劑量為50-400μg/次，免疫周期間隔為5-7天，在一定的范圍內(nèi)，抗體的效價(jià)