抗腫瘤藥物篩選課件

抗腫瘤藥物篩選侯桂琴鄭州大學(xué)藥學(xué)院一細(xì)胞篩選篩選方法1.四氮唑藍(lán)（MTT）還原法原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值應(yīng)用：用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。特點(diǎn)：靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。

缺點(diǎn)：產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。步驟：（1）制備單細(xì)胞懸液；(2)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后接種于96孔板，一般每孔細(xì)胞數(shù)為5000個(gè)（可先做細(xì)胞倍增試驗(yàn)確定每孔中最佳細(xì)胞數(shù)）；（3）將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱，過(guò)夜培養(yǎng)；（4）24h后更換培養(yǎng)基，并在每孔細(xì)胞中加入不同濃度藥物，繼續(xù)培養(yǎng)；（5）24或48h以后，加入MTT溶液，再培養(yǎng)3-6h,停止培養(yǎng)，棄取培養(yǎng)基,加入DMSO，每孔150ul，輕微震蕩混勻；（6）把96孔板放入酶標(biāo)儀中，490nm測(cè)定吸光度。CCK-8法2.集落形成法：測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的增殖能力原理：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)分裂增殖6次以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，稱克隆或集落。一般50個(gè)以上細(xì)胞，通過(guò)計(jì)數(shù)克隆形成率，定量分析單個(gè)細(xì)胞的增殖能力。用途：抗癌藥物敏感性試驗(yàn)，腫瘤放射生物學(xué)試驗(yàn)常用方法：平板克隆形成試驗(yàn)，軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)注意：適合貼壁細(xì)胞，細(xì)胞要分散均勻，操作要柔和。3.臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)原理：臺(tái)盼藍(lán)能使死細(xì)胞著色（淡藍(lán)色），而活細(xì)胞拒染。

活細(xì)胞總數(shù)×100活細(xì)胞率（％

）＝活細(xì)胞總數(shù)＋死細(xì)胞總數(shù)注意：簡(jiǎn)單，最常用。染色時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。特點(diǎn)：懸浮細(xì)胞較方便，貼壁細(xì)胞要進(jìn)行消化，此步誤差大。二微生物學(xué)篩選方法(抗腫瘤抗生素)1.噬菌體法噬菌體：是一類能感染微生物的病毒（1）抗噬菌體法：干擾DNA代謝的抗生素如放線菌素、博來(lái)霉素常能抑制噬菌體在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)，從而不產(chǎn)生噬菌體顆粒而出現(xiàn)抗噬菌體的現(xiàn)象。（2）溶原性菌誘導(dǎo)法：除烈性噬菌體外，還有一種噬菌體，其基因組直接螯合到細(xì)菌染色體DNA，不復(fù)制，因其大部分基因功能受到了“阻遏物”阻抑，這種帶前噬菌體的菌株稱溫和性或溶原性菌。但是當(dāng)“阻遏物”的量由于細(xì)胞內(nèi)或環(huán)境因子（物理、化學(xué)）而降低時(shí)，溶原性就不能維持，前噬菌體開始生長(zhǎng)，是細(xì)菌裂解，稱為誘導(dǎo)作用。一些抗腫瘤抗生素有誘導(dǎo)能力。2.細(xì)菌變種法(1)人工培育變種如:使細(xì)菌模仿腫瘤細(xì)胞的某些代謝特點(diǎn)使細(xì)菌對(duì)核酸或蛋白合成抑制劑敏感(2)檢測(cè)突變作用如:依賴鏈霉素的菌株3.抗代謝法

抗代謝物在無(wú)機(jī)氮源的合成培養(yǎng)基中顯示抗菌作用，而在普通有機(jī)氮源的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中無(wú)抗菌作用（因?yàn)橛袡C(jī)氮源可將具有抗菌作用的物質(zhì)代謝），利用此特點(diǎn)，選擇無(wú)機(jī)氮源試驗(yàn)有抗菌作用的物質(zhì)，作為抗代謝的初篩方法。三精原細(xì)胞法(抗生素和植物藥)1.建立依據(jù)B型精原細(xì)胞具有高度敏感性2.實(shí)驗(yàn)方法及判定22－28g雄性小鼠，藥物直接注入睪丸，不同濃度，每一濃度用2－3只，注射3天，處死動(dòng)物，睪丸固定，石蠟包埋切片，蘇木精－伊紅染色，顯微鏡觀察。四利用分子靶點(diǎn)篩選1.抑制血管生成的篩選模型體外：血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體內(nèi)：動(dòng)物眼角膜囊地鼠頰囊裸鼠外耳皮下雞胚絨毛尿囊膜雞胚絨毛尿囊膜模型雞胚的生物學(xué)構(gòu)造尿囊卵黃囊對(duì)照組低濃度藥物實(shí)驗(yàn)組中濃度藥物實(shí)驗(yàn)組高濃度藥物實(shí)驗(yàn)組操作步驟：（1）于實(shí)驗(yàn)前72h孵育受精蛋（2）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前以照蛋箱透照孵育的種蛋，凡已正常發(fā)育的種蛋可照見胚胎的影子，用鉛筆做記號(hào)，棄取未發(fā)育種蛋（3）用碘酒、酒精消毒蛋殼。敲碎蛋殼把雞胚移入平皿中，加入EagleFs培養(yǎng)液5-10ml，然后，可選擇在雞胚尿囊膜血管網(wǎng)的任何位置放置小塊明膠海綿作為篩選抗血管生成藥物的載體，然后加入不同濃度的血管生成抑制劑。（4）于加藥后24h、48h和72h分別在顯微鏡下觀察藥物作用結(jié)果，并照相。（5）血管計(jì)數(shù)。可結(jié)合自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)、攝像等技術(shù)完成血管生成抑制率＝（對(duì)照組血管面積－藥物組血管面積）/對(duì)照組血管面積×100％2.以端粒酶為靶點(diǎn)的藥物篩選端粒：真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)。功能是維持染色體穩(wěn)定性。，防止染色體DNA降解，保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)基因，調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長(zhǎng)。“生命的時(shí)鐘”“有絲分裂的計(jì)數(shù)器”端粒酶功能：通過(guò)其逆轉(zhuǎn)錄酶活性復(fù)制和延長(zhǎng)端粒DNA來(lái)穩(wěn)定染色體DNA端粒的長(zhǎng)度。端粒酶活性測(cè)定方法端粒酶抑制劑3.細(xì)胞凋亡通路靶點(diǎn)

細(xì)胞周期調(diào)控靶點(diǎn)與侵襲相關(guān)的靶點(diǎn)耐藥相關(guān)的分子靶點(diǎn)靶點(diǎn)選擇原則：特異性、有效性、綜合性、個(gè)性化五動(dòng)物模型整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法是評(píng)價(jià)一個(gè)藥物是否有效的最主要方法整體動(dòng)物在腫瘤藥理學(xué)研究中的作用：1.研究新開發(fā)藥物對(duì)腫瘤的防治作用；2.對(duì)抗腫瘤藥物進(jìn)行篩選，探索抗腫瘤機(jī)理；3.探索藥物和目前常規(guī)腫瘤治療方法的綜合應(yīng)用以提高療效。

常用宿主動(dòng)物：裸小鼠（“活的試管”）特點(diǎn)：先天無(wú)毛，無(wú)胸腺，T淋巴細(xì)胞功能完全缺失，對(duì)異種移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。缺點(diǎn)：費(fèi)用高，飼養(yǎng)條件高，不宜大量繁殖。一般不用于初篩。應(yīng)用：觀察藥物對(duì)癌細(xì)胞逆轉(zhuǎn)作用，抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用。C57BL/6小鼠特點(diǎn)：黑毛，體型小，性情溫順，易飼養(yǎng)，藥敏性好，為研究Lewis肺癌首選。應(yīng)用：藥物體內(nèi)初篩。模型建立方法實(shí)體瘤建立及評(píng)價(jià)：1.小塊瘤體接種法2.腫瘤細(xì)胞懸液接種法3.培養(yǎng)細(xì)胞移植法療效評(píng)價(jià)：腫瘤抑制率＝（對(duì)照組瘤重－給藥組瘤重）/對(duì)照組瘤重×100％腹水瘤建立及評(píng)價(jià)：評(píng)價(jià)：對(duì)照組通常2-3周內(nèi)死亡，治療組一般觀察50d左右，計(jì)算生命延長(zhǎng)率。生命延長(zhǎng)率＝（治療組平均存活天數(shù)－對(duì)照組平均存活天數(shù)）/對(duì)照組平均存活天數(shù)×100aysTumorValume(mm3)ACabcdBab六基因芯片技術(shù)1.原理是一種建立在雜交測(cè)序基本理論上的全新技術(shù)，它利用固定在芯片上的幾萬(wàn)至幾十萬(wàn)條探針與樣品進(jìn)行雜交，在一步實(shí)驗(yàn)中獲取大量的信息。2.基本技術(shù)路線①基因的選擇與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)選擇5000-10000個(gè)與發(fā)育及疾病相關(guān)的基因，制備藥物篩選芯片。②芯片的制備③細(xì)胞的培養(yǎng)與藥物刺激

根據(jù)目的藥物及表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)胞表達(dá)譜選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，用適當(dāng)計(jì)量的藥物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，不同的時(shí)間取樣，抽提刺激前后的mRNA。④大白鼠飼養(yǎng)與藥物刺激

用常規(guī)方法飼養(yǎng)大白鼠，用適當(dāng)計(jì)量的藥物喂養(yǎng)大白鼠，不同的時(shí)間取大白鼠的適當(dāng)器官（根據(jù)所篩選的藥物而定），