軟骨藻酸檢測方法研究進(jìn)展

軟骨藻酸檢測方法研究進(jìn)展

隨著赤潮災(zāi)難的持續(xù)，赤潮毒素引起了世界沿海地區(qū)的中毒事件。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界因赤潮毒素的貝類中毒事件約300多起,死亡300多人。近年來,在我國福建、臺(tái)灣、香港等地均有赤潮毒素中毒事件的發(fā)生。因此,赤潮藻毒素的污染狀況不容小覷。根據(jù)對人類的中毒癥狀和機(jī)制差異,可將赤潮毒素分為麻痹性貝毒(Paralyticshellfishpoisoning,PSP)、腹瀉性貝毒(Diarrheticshellfishpoisoning,DSP)、記憶缺失性貝毒(Amnesiashellfishpoisoning,ASP)、神經(jīng)性貝毒(Neurotoxicshellfishpoisoning,NSP)、西加魚毒(Ciguaterafishpoisoning,CFP)、海兔毒素(Aplysiatoxins)和前列腺素(Prostaglandins,PGs)。軟骨藻酸(Domoicacid,DA)正是記憶缺失性貝毒(ASP)的主要成分。DA是由硅藻門(Baciilariophyta)、羽紋硅藻綱(Pennatae)、管殼縫目(Aulonoraphidinals)、菱形藻科(Nitzschiaceae)中的擬菱形藻屬(Pseudo-nitzschia)和菱形藻屬(Nitzschia)中硅藻的某些種產(chǎn)生的。筆者總結(jié)了近年來軟骨藻酸的污染狀況和對人類的危害,同時(shí)分析軟骨藻酸檢測技術(shù)。1紅藻氨酸受體的檢測DA(分子式C15H21NO6,分子量311.3)是由水中藻類產(chǎn)生的一種生物毒素,結(jié)構(gòu)與紅藻氨酸和谷氨酸相似,是紅藻氨酸受體的興奮劑。DA純品為白色固體粉末,熔點(diǎn)為223～224℃,溶于水,微溶于甲醇,在紫外光譜區(qū)最大吸收波長為242nm。在體積比為1∶9的乙睛/水的溶液中,-12℃黑暗條件下,DA可1年左右保持穩(wěn)定。它有3種同分異構(gòu)體,分子式如圖1所示。2貝類生物積累作用人體多通過食用貝類、魚類的途徑攝入軟骨藻酸的。人攝入受DA污染的貝類時(shí),胃腸黏膜會(huì)吸收DA。純品DA也可通過呼吸道、角膜和皮膚直接進(jìn)入體內(nèi),以帶電親水分子形式分布于血管周圍組織中。DA是一種興奮性神經(jīng)毒素,它和作為神經(jīng)遞質(zhì)的谷氨酸(Glu)一樣具有引起神經(jīng)細(xì)胞興奮的功能,但其強(qiáng)度比Glu高100多倍,比紅藻氨酸(KA)高2～3倍。DA可通過與谷氨酸機(jī)制相同的腦部通路進(jìn)入腦,即血腦屏障的高親和性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入腦。中毒后,人體會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、胃炎,嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致頭暈眼花、視覺障礙、記憶喪失、昏迷等。近些年由于赤潮頻發(fā),已在多個(gè)地區(qū)多種生物體內(nèi)檢測到軟骨藻酸的存在(表1)。Vale等通過對葡萄牙貝類的研究發(fā)現(xiàn)不同的貝類品種在不同的時(shí)空對于DA的生物積累作用也是不同的。其中,春季捕撈的花蛤(Venerupis)對DA的生物積累作用最大。Wekell等于1991～1993年對不同季節(jié)的蛤蜊、蛤蜊的組織進(jìn)行軟骨藻酸含量測定,發(fā)現(xiàn)其可食用部分DA含量在12月達(dá)到最高,平均可達(dá)106mg/kg,此后逐漸下降,但在濃度達(dá)到高峰后16個(gè)月,蛤蜊體內(nèi)的DA仍不能完全消失;此外,蛤蜊的各個(gè)部位均能檢出DA,其中足部濃度最高,可達(dá)223mg/kg,虹吸管部位的濃度最低。Lefebvre等對大馬哈魚(Oncorhynchuskiautch)體內(nèi)不同組織的DA含量進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)DA在大馬哈魚的腎和膽中的含量較高。圖2是DA在大馬哈魚體內(nèi)不同組織器官內(nèi)的分布情況。人類通過食用海產(chǎn)品攝入DA,多通過食用貽貝、蛤類在體內(nèi)積累。與貝類相比,人類通過食用魚類而受到的影響較小。據(jù)研究,當(dāng)人體內(nèi)DA含量在0.2～0.3mg/kg(濕重)時(shí),機(jī)體不受影響;當(dāng)達(dá)到0.9～2.0mg/kg(濕重)時(shí),機(jī)體會(huì)出現(xiàn)輕度眩暈等癥狀;當(dāng)達(dá)到1.9～4.0mg/kg(濕重)時(shí),機(jī)體會(huì)出現(xiàn)方位障礙等癥狀。Costa等通過對歐洲食品安全委員會(huì)數(shù)據(jù)的研究,發(fā)現(xiàn)歐洲居民對于貝類的實(shí)際消費(fèi)量比之前研究所得的數(shù)據(jù)高,尤其是德國和荷蘭,并總結(jié)出歐盟主要國家居民對于軟骨藻酸的暴露水平。表2是歐洲一些國家的貝類消費(fèi)和人體積累DA的情況。另外,DA具有熱穩(wěn)定性,一般的烹飪過程并不能夠破壞軟骨藻酸的毒性。雖然一般家庭的蒸和煮的過程會(huì)減少貝類組織中的DA含量,但是DA仍會(huì)隨烹飪過程進(jìn)入到烹飪油中,進(jìn)而通過消化道進(jìn)入人體。軟骨藻酸作為一類神經(jīng)毒素、遞質(zhì)和阻斷劑在貝類組織中積累,進(jìn)而間接地影響著人類的健康。目前對由DA引起的健忘性貝中毒還沒有較好的療法,僅在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用苯二氮草(Diazepan,5mg/kg)可減少震顫行為,但無法完全恢復(fù)受損的海馬結(jié)構(gòu)或空間記憶能力。同時(shí),研究表明軟骨藻酸對昆蟲有殺滅能力,其對嶂螂、蒼蠅的殺死效果不遜于r-BHC等。隨著赤潮發(fā)生頻率的升高,軟骨藻酸對人類的威脅越來越嚴(yán)峻,選擇研發(fā)合適的、快速的、簡單的、低成本的檢測技術(shù)已越來越急迫。3檢測技術(shù)3.1大鼠生物檢測法3.1.1小鼠生物分析法該法是根據(jù)美國公職化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)所標(biāo)定的麻痹性貝中毒(PSP)的小鼠生物分析法加以變化的,是最早用于DA檢測的一種經(jīng)典方法。其原理是將毒素注射入小白鼠體內(nèi),根據(jù)注射后小鼠的存活時(shí)間和中毒癥狀來評(píng)價(jià)毒性,一般用半致死劑量表示。3.1.2生物檢測法檢測該法更加注重研究DA的毒性效應(yīng)和毒理研究。這是一般其他方法無法取代的,而且采用小白鼠生物檢測法可以檢測一些未知的毒性物質(zhì),通過半數(shù)致死劑量來評(píng)價(jià)該物質(zhì)的毒性效應(yīng),因此小白鼠生物檢測法目前在各個(gè)國家仍有很廣泛的應(yīng)用。但是,該方法的檢出限較高,適用于檢測貝類組織中高濃度的DA(300～1000μg/g),不適用于DA含量低于20μg/g組織的檢測。3.2高效液相色譜法3.2.1復(fù)配、熒光分析高效液相色譜法能夠靈敏、快速、準(zhǔn)確地確定各種毒素成分,被廣泛應(yīng)用于研究和確認(rèn)試驗(yàn)。貝類樣品被提取后,經(jīng)濃縮純化后進(jìn)行HPLC配紫外檢測器(HPLC-UV)、熒光檢測器(HPLC-FLD)或質(zhì)譜儀(HPLC-MS)分析。很多國家已經(jīng)把高效液相色譜法列為國標(biāo)法,例如我國規(guī)定海產(chǎn)品雙殼類貝肉、貝柱、外套膜及其制品的記憶喪失性貝毒軟骨藻酸的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法,檢出限為1.0μg,線性范圍為1～250μg。3.2.2高效液相色譜-質(zhì)譜法高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)特別適用于貝類組織中DA含量的測定,尤其適用于毒素含量超過20μg/g的情況。張一兵等在借鑒國外方法的基礎(chǔ)上應(yīng)用高效液相色譜-紫外可見檢測法(HPLC-UVD)進(jìn)一步優(yōu)化了DA的高效液相色譜-紫外檢測法,選定pH2的甲醇/水=22∶78(V/V)為流動(dòng)相,LC-SAX作為濃縮純化柱,檢出限為10ng,回收率達(dá)到92%～94%。陳西平等應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法(HPLC-DAD)檢測水和水生生物中的軟骨藻酸,回收率達(dá)到70%～93%,檢出限為10ng。檢測結(jié)果表明,我國部分海產(chǎn)品中含有DA,淡水中未含有DA。高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)法是一種準(zhǔn)確度好、靈敏度高的測定藻毒素的方法。高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)可以不使用衍生試劑和毒素標(biāo)準(zhǔn)品,相比其他檢測器具有很大的優(yōu)勢。然而,該方法對設(shè)備條件要求較高,現(xiàn)階段還不能大量用于基層的日常監(jiān)測工作。Vale等利用HPLC-MS的方法,以1+1的甲醇溶液作為洗脫液,對葡萄牙魚類和貝類體內(nèi)的軟骨藻酸含量進(jìn)行測定,結(jié)果表明在春季樣品中DA含量最高;在分析的眾多樣品中,蛤仔和鳥蛤被軟骨藻酸污染最為嚴(yán)重,紫貽貝和牡蠣等物種受污染較輕。陳燕青等利用HPLC-MS法測定蝦夷扇貝和長牡蠣中軟骨藻酸的殘留,樣品經(jīng)濃度50%甲醇提取,LC-SAX柱凈化,3ml0.1mol/L甲酸溶液洗脫,電噴霧離子源(ESI),在正離子、多反應(yīng)監(jiān)測方式(MRM)模式下進(jìn)行定性與定量,該方法的檢出限達(dá)0.01μg/g,線性范圍為0.02～10.00μg/g。高效液相色譜-熒光法具有更高的靈敏度,將熒光基團(tuán)連接到DA上進(jìn)而使用熒光檢測器檢測,檢出限可達(dá)到pg/ml。Maroulisb等利用柱后衍生法測定DA,加入4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑(NBD-Cl)與DA上的氨基反應(yīng)生成熒光基團(tuán),提高了熒光檢測檢測器(FLD)的靈敏度,熒光檢測器激發(fā)波長設(shè)為469和529nm,檢出限低至25μg/kg。但是,HPLC-FLD檢測法的衍生劑價(jià)格昂貴,設(shè)備操作復(fù)雜,因此HPLC-FLD熒光法的應(yīng)用并不是很廣泛。3.3酶聯(lián)免疫吸附法elisa3.3.1igg定量測定酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)即ELISA,是一種常用的固相酶免疫測定方法。Engvall和Perlmann于1971年最先應(yīng)用該法進(jìn)行IgG定量測定,并命名為Enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)。由于ELISA方法靈敏,特異性強(qiáng)不需要特殊設(shè)備,被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。將ELISA應(yīng)用于DA的檢測中,利用原-抗體反應(yīng),采用特異性貝類毒素的抗體來檢測DA。3.3.2elisa方法與高效液相色譜法的對比Newsome等開發(fā)了DA的ELISA方法,并成功檢測尿樣和血液中的DA含量,工作曲線的范圍為150～1200ng/ml,并驗(yàn)證ELISA方法是檢測DA的一種靈敏度非常高的方法。YU等制備了DA的多克隆抗體,并繼續(xù)優(yōu)化了直接競爭ELISA方法,使檢出限降至0.02ng/ml,并對臺(tái)灣的貝類產(chǎn)品進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明貝類產(chǎn)品中的DA含量在安全范圍內(nèi)。Smith等對間接競爭ELISA法和高效液相色譜法(HPLC)2種方法進(jìn)行了對比。ELISA方法比高效液相色譜法有更低的檢出限,線性相關(guān)系數(shù)(r)達(dá)到了0.96。Garthwaite等成功制備了DA多克隆抗體,利用間接競爭ELISA的方法即抗體、抗原和二抗之間的競爭反應(yīng)來定量測定DA的含量,并對海水、海產(chǎn)品中的DA進(jìn)行了檢測,檢出限為0.15ng/ml,線性范圍為0.15～15ng/ml,優(yōu)化了ELISA方法的檢出限和線性范圍。許道艷等通過免疫小鼠得到多克隆抗體,利用抗體抗原的反應(yīng)建立了間接競爭ELISA方法,檢出限為10μg/L,與HPLC檢測結(jié)果的相關(guān)度達(dá)到0.9921。隨著科技的發(fā)展,現(xiàn)有的多克隆抗體逐漸被特異性更好的單克隆抗體取代,單克隆抗體在ELISA方法的應(yīng)用大大地提高了ELISA方法的特異性和靈敏度。Kawatsu等首次采用單克隆抗體制備技術(shù),建立檢測DA的間接競爭ELISA法,檢測限低至0.15～10.00ng/ml。國內(nèi)方面,高利利等利用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)成功制備了能穩(wěn)定分泌抗軟骨藻酸單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,并通過體內(nèi)誘生腹水并純化后,得到效價(jià)為1∶64000的單克隆抗體,為進(jìn)一步開發(fā)軟骨藻酸快速檢測ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。3.4毛細(xì)管電泳法ce3.4.1液相分離技術(shù)毛細(xì)管電泳技術(shù)是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)新型分析技術(shù),兼有電泳和色譜技術(shù)的雙重優(yōu)點(diǎn),以毛細(xì)管為分離通道,以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力,以樣品的多種特性(電荷大小、等電點(diǎn)、極性、親和行為、各組分之間淌度、相分配特性等)為依據(jù)的液相分離分析技術(shù)。3.4.2樣品的檢出率Zhao等建立毛細(xì)管電泳—紫外檢測法用于檢測貽貝、縊蟶、鳳尾魚等樣品,最低能檢出150ng/gDA。衛(wèi)峰等利用毛細(xì)管電泳法分析了貝類樣品中的DA,檢出限達(dá)到0.034μg/g。3.5生物傳感器法此外,還有很多檢測DA的方法,例如薄層色譜法(TLC)、生物傳感器法等。但是,薄層色譜法、生物傳感器法等靈敏度和準(zhǔn)確度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及色譜法,所以應(yīng)用不及色譜法和免疫學(xué)方法廣泛。4da主要檢測方法的比較4.1試驗(yàn)結(jié)果采用“生物檢測法”小白鼠生物檢測法方法的各項(xiàng)特性指標(biāo)為:檢出限300～1000μg/g,檢測周期大于24h,特異性較差,干擾因素較多,樣品處理為粗略提取,樣品批次單一。小白鼠生物檢測法檢測DA是最早使用的一種方法,但是其試驗(yàn)結(jié)果受外部影響因素較為復(fù)雜,試驗(yàn)結(jié)果與小白鼠的品系和試驗(yàn)者本身操作有很大關(guān)系,并且小白鼠生物檢測法一般要有至少1d的檢測周期,該方法的檢出限較低。此外,小白鼠生物法僅能測定毒性的大小,無法確定毒素的組成和各成分的含量。小白鼠生物檢測法最大的局限性是小鼠本身造成結(jié)果的高變異性和低敏感性,而且對鼠種的要求較高。所以,急需開發(fā)更加先進(jìn)的、快速的、準(zhǔn)確的、定量的儀器分析方法。4.2高效液相色譜法的優(yōu)缺點(diǎn)高效液相色譜法是目前化學(xué)分析較為常用的方法。高效液相色譜法檢出限低,方法成熟,但儀器昂貴、笨重,一次只能測定一個(gè)樣品,不適合快速現(xiàn)場檢測。高效液相色譜法的各項(xiàng)特征指標(biāo)見表3。4.3elisa法的檢出限和測定周期ELISA法是近些年來利用抗體抗原的特異性反應(yīng)來檢測污染物的一種新興技術(shù)?？贵w抗原反應(yīng)靈敏、特異性高,所以ELISA法的檢出限非常低,檢測時(shí)間短,但是該方法干擾因素很多,貝類或藻類樣品的提取純化工作比較復(fù)雜。該方法一次可以測定多組樣品,檢測周期較短。ELISA法的各項(xiàng)特征指標(biāo)[30,32,34,40,43,44]見表4。ELISA法近些年的發(fā)展非常迅速,國外已經(jīng)有商業(yè)化軟骨藻酸ELISA試劑盒,而我國目前在這方面的研究并不充分,需要進(jìn)一步的發(fā)展。5elisa法的局限性和應(yīng)用前景展望自1987年加拿大愛德華王子島的東海岸爆發(fā)食用被軟骨藻酸污染的紫貽貝引起人類中毒死亡事件以來,軟骨藻酸的污染范圍已經(jīng)擴(kuò)展到美國