微生物學教學課件：第6章 細菌的生長及其控制

第6章細菌的生長及其控制

第一節(jié)測定微生物生長繁殖的方法第二節(jié)微生物的生長規(guī)律第三節(jié)影響微生物生長的主要環(huán)境因素第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論第五節(jié)微生物生長繁殖的控制

生長與繁殖生長:生物個體物質有規(guī)律地、不可逆增加，導致總量（體積、大小、重量）擴大的生物學過程。繁殖:生物個體生長到一定階段，通過特定方式產生新的生命個體，即引起生命個體數(shù)量增加的生物學過程。

生長=量變

繁殖=質變

單個微生物細胞合適的外界條件，吸收營養(yǎng)物質，進行代謝。同化作用的速度超過了異化作用個體的生長原生質的總量（重量、體積、大?。┚筒粩嘣黾尤绻骷毎M分是按恰當?shù)谋壤鲩L時，則達到一定程度后就會發(fā)生繁殖，引起個體數(shù)目的增加。群體內各個個體的進一步生長群體的生長在一定時間和條件下細胞數(shù)增加（微生物群體生長），即“生長”，一般均指群體生長。群體生長=個體生長＋個體繁殖第一節(jié)測定微生物生長繁殖的方法微生物生長的測定：個體計數(shù)、群體重量測定和群體生理指標測定。目的：評價培養(yǎng)條件、營養(yǎng)物質等對微生物生長的影響；評價不同的抗菌物質對微生物產生抑制(或殺死)作用的效果；客觀地反映微生物生長的規(guī)律。第一節(jié)測定生長繁殖的方法一、測生長量直接法

測體積法稱干重法測定絲狀真菌常用方法間接法比濁法目測或分光光度法（450-650nm）生理指標法測含氮、碳、磷量稱干重法將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾分離出來，然后烘干（干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃）、稱重。一般干重為濕重的10%～20%，而一個細菌細胞一般重約10-12～10-13g。該法適合菌液濃度較高的樣品。比濁法：借助于分光光度計，在一定波長（450~650nm波段)下測定菌懸液的光密度，就可反應出菌液的濃度。原理：在一定范圍內，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。特點：快速、簡便。如何定量二者關系呢？濁度儀①繪制標準曲線

②測菌液濁度，對照標準曲線得出細菌數(shù)量

生理指標法測含氮量：蛋白質是細胞的主要物質，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。其他方法：含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產CO2、產酸、產熱、粘度等，都可用于生長量的測定。測繁殖數(shù)直接法計數(shù)板間接法平板菌落計數(shù)法計數(shù)板構造25X16型血球計數(shù)板間接法（活菌計數(shù)法）①平板菌落計數(shù)法②膜過濾培養(yǎng)法微生物生長測定方法比較測定細胞數(shù)目方法特點與應用血球計數(shù)板法較快速簡便，但較費時薄膜過濾染色法快速簡便，適于含菌數(shù)很低的空氣、水等中的總菌計數(shù)

平皿菌落計數(shù)法簡易價廉，但花費時間較長，不能立刻知道結果測定物質量比濁法快速簡便，敏感度低，適于不發(fā)酵液或液體中的快速總細胞數(shù)估計，但需事先標定細胞濕重法較為簡便，但含水量不定，準確度差細胞成分含量法如測定蛋白質、核酸、還原糖的含量等細胞干重法較為費時，易受顆粒雜質干擾，敏感度低第二節(jié)微生物的生長規(guī)律同步生長的概念：采用一定的方法使細胞群體處于分裂步調一致的狀態(tài)。環(huán)境誘導法：變換溫度、光線或對于穩(wěn)定期的培養(yǎng)物添加新鮮培養(yǎng)液。物理學方法：通過物理學方法選擇。例如選擇性過濾或梯度離心法。環(huán)境條件誘導法：如用氯霉素抑制、藻胞的光照、黑暗、控制等，可能造成細胞循環(huán)周期改變。機械選擇法：膜過濾法、膜洗脫法、密度梯度離心法等。同步生長法特點：同步性喪失：在培養(yǎng)過程中，其同步性喪失較快。喪失的原因：群體中的不同細胞個體間分裂周期差異。獲得同步生長的方法：誘導法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等。造成與正常細胞周期不同的周期變化。選擇法：選擇性過濾、梯度離心。物理方法，隨機選擇，不影響細胞代謝。原理：細菌細胞會緊緊粘附于硝酸纖維微孔濾膜上。步驟：菌懸液通過微孔濾膜，細胞吸附其上；反置濾膜，以新鮮培養(yǎng)液通過濾膜，洗掉浮游細胞；除去起始洗脫液后就可以得到剛剛分裂下來的新生細胞，即為同步培養(yǎng)。典型生長曲線概念：定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實驗曲線稱為生長曲線（growthcurve）。條件：將少量純種單細胞微生物群體、接入適宜的恒定容積的培養(yǎng)液中，在適宜溫度、通氣與酸堿度等條件下，微生物群體細胞量有規(guī)律地增加的過程。只適用于單細胞微生物如細菌和酵母菌。生長曲線代表了單細胞微生物在新的環(huán)境中從開始生長、分裂直至死亡的整個動態(tài)變化過程。生長曲線（growthcurve）結果：根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)（growthrateconstant）即每小時分裂次數(shù)（R）的不同，以細胞數(shù)目的對數(shù)值為縱坐標與培養(yǎng)時間作橫坐標，繪制出的由延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段組成的曲線。典型生長曲線延滯期指數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期生長曲線生長曲線圖示延滯期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期又稱：停滯期、調整期、適應期－“萬事開頭難”特點：生長速率常數(shù)R=0;細胞形態(tài)變大或增長;細胞內RNA特別是rRNA含量增高，原生質嗜堿性增強;合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產生誘導酶;對外界不良條件反應敏感（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等理、化學藥物）。（一）延滯期延滯期產生原因移植規(guī)律：群體移植后產生延滯期是生命活動的基本規(guī)律，是適應新環(huán)境需要一定的時間的表現(xiàn)。原因：因誘導酶、ATP、[H]及各種原材料等的合成需環(huán)境及時間。細胞修復：細胞損傷部分的修復需一定的時間。在發(fā)酵工業(yè)上需設法盡量縮短延遲期，措施有：①接種齡：對數(shù)生長期的菌種接種,子代停滯期短；穩(wěn)定期的菌種接種，子代停滯期居中；停滯期或衰亡期菌種接種，子代停滯期長。②增加接種量；一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）。③調整培養(yǎng)基的成分，應適當豐富，且發(fā)酵培養(yǎng)基成分盡量與種子培養(yǎng)基的成分接近。（2）指數(shù)期（exponentialphase）又稱對數(shù)期（logarithmicphase）：群體細胞分裂與其數(shù)量以幾何級數(shù)增加的一段時期。特點：生長速率最大、代時最短；細胞進行平衡生長;酶系活躍、代謝旺盛。指數(shù)期幾個名詞R：生長速率常數(shù)即為單位時間內生物體細胞所分裂的代數(shù)值(每小時分裂的次數(shù))。G：代時即為生物體細胞每分裂一次所需時間或群體細胞的原生質體增加一倍所花的倍增時間。N：繁殖代數(shù)即指生物群體的全部在單位時間內共繁殖的代數(shù)。生長限制因子：凡在培養(yǎng)液中處于較低濃度范圍內，可影響生長速率和菌體產量的營養(yǎng)物或營養(yǎng)因子。

一些細菌的代時體溫菌：大腸桿菌——G=12.5～17min

枯草桿菌——G=26～32min室溫菌：褐球固氮菌—G=240min

大豆根瘤菌—G=410min嗜熱菌：嗜熱芽胞菌—G=18min（1）菌種：不同菌種其代時差別極大。（2）營養(yǎng)成分：同一種微生物，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上生長時，其代時較短，反之則長。（3）營養(yǎng)物濃度：既影響微生物的生長速率，又影響它的生長總量。（4）培養(yǎng)溫度：溫度對微生物的生長速率明顯的影響。影響指數(shù)期微生物代時長短的因素指數(shù)期的應用特性：群體生理特性一致，細胞成分平衡發(fā)展和生長速率恒定。應用：宜作發(fā)酵種子；是代謝、生理研究的好材料；是增殖噬菌體的最佳菌齡。(3）穩(wěn)定期（stationaryphase）生長速率常數(shù)為零；（新繁殖細胞數(shù)=衰亡細胞數(shù)）菌體產量達到最高點。菌體產量與營養(yǎng)物消耗間呈比例關系（用生長產量常數(shù)Y表示）。 胞內出現(xiàn)貯藏物（糖原、異染顆粒和脂肪等）；形成芽胞。 產生抗生素等次生代謝物。穩(wěn)定期到來的原因消耗：營養(yǎng)物的消耗失調：營養(yǎng)物的比例失調（碳氮比）累積：有害代謝產物的累積（酸、醇、毒素等）不適：物化條件不適宜（pH、氧化還原電勢等）穩(wěn)定期與生產實踐SCP收獲期：以菌體量為主的最佳收獲期產物收獲期：與菌體相平行的代謝產物的收獲生物測定：宜作生物測定的菌源（維生素、堿基、氨基酸）連培的依據(jù)：啟示連續(xù)培養(yǎng)的主要依據(jù)（4）衰亡期1、特點：（1）細胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過新增殖的細胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)“負生長”

（

R＜0）；（2）細胞出現(xiàn)多形態(tài)，畸形或衰退形；（3）因菌體本身產生的水解酶及代謝產物的作用，使菌體死亡、自溶等。（4）有的微生物進一步合成或釋放次生代謝物。（5）芽孢桿菌在此期釋放芽孢等。衰亡期到來原因失調：碳氮比嚴重失調耗盡：培養(yǎng)基內營養(yǎng)物近耗盡惡化：培養(yǎng)環(huán)境的進一步惡化原因：分解代謝大于合成代謝，從而導致大量菌體進入死亡期生長特點成因菌體特征應用及其它調整期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期不立即繁殖繁殖速度最快出生率等于死亡率,活菌數(shù)最大,代謝產物大量積累死亡超過繁殖適應新環(huán)境條件適宜生存條件開始惡化生存條件極度惡化代謝活躍,體積增長較快個體形態(tài)和生理特性穩(wěn)定有些種類出現(xiàn)芽孢出現(xiàn)畸變與菌種和培養(yǎng)條件有關生產用菌種科研材料改善和控制條件,延長穩(wěn)定期細胞裂解釋放產物單細胞微生物生長的四個時期絲狀微生物的群體生長絲狀微生物的純培養(yǎng)采用孢子接種，在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)或深層通氣加攪拌培養(yǎng)，菌絲體通過斷裂繁殖不形成產孢結構。以菌絲干重作為衡量生長的指標，即以時間為橫坐標，以菌絲干重為縱坐標，繪制生長曲線。培養(yǎng)時間與菌絲體干重的立方根成直線關系。1、生長停滯期:孢子萌發(fā)前真正的停滯狀態(tài)2、迅速生長期:生長主要表現(xiàn)在菌絲尖端的伸長和出現(xiàn)分支、斷裂等，此時期的菌體呼吸強度達到高峰，有的開始積累代謝產物。3、衰退期:菌絲體干重下降，到一定時期不再變化。絲狀微生物的群體生長曲線連續(xù)培養(yǎng)分批培養(yǎng)（batchculture）：又稱封閉培養(yǎng)（closedculture），將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入，不再補充和更換，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）：又稱開放培養(yǎng)（openculture），在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質，同時排除含菌體及代謝產物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時間地處于對數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。連續(xù)培養(yǎng)的實現(xiàn)通過認識穩(wěn)定期到來的原因，并采取有效措施實現(xiàn)。當微生物以單批培養(yǎng)的方式培養(yǎng)到指數(shù)期的后期時，一方面以一定的速度連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液（并通入無菌空氣，立即進行攪拌）；另一方面以同樣流速流出發(fā)酵液至動態(tài)平衡。特點：可使發(fā)酵長期保持在指數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和衡定的生長速率上。連續(xù)培養(yǎng)器按控制方式分按培養(yǎng)器的級數(shù)分按細胞狀態(tài)分按用途分內控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長速率）：恒化器單級連續(xù)培養(yǎng)器多級連續(xù)培養(yǎng)器一般連續(xù)培養(yǎng)器固定化細胞連續(xù)培養(yǎng)器實驗室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器發(fā)酵生產用：連續(xù)發(fā)酵罐連續(xù)培養(yǎng)器特點：基質過量，微生物始終以最高速率進行生長，并可在允許范圍內控制不同的菌體密度；但工藝復雜，煩瑣。使用范圍：用于生產大量菌體、生產與菌體生長相平行的某些代謝產物，如乳酸、乙醇等。（1）恒濁器—

恒濁連續(xù)培養(yǎng)（2）恒化器—

恒化連續(xù)培養(yǎng)特點：維持營養(yǎng)成分的適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產量低于最高菌體產量。應用范圍：實驗室科學研究。裝置控制對象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長速率產物應用范圍恒濁器菌體密度（內控制）無限制生長因子不恒定最高大量菌體或與菌體形成相平行的產物生產為主恒化器培養(yǎng)基流速（外控制）有限制生長因子恒定低于最高不同生長速率的菌體實驗室為主恒濁器與恒化器的比較連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點優(yōu)點：高效；自控；穩(wěn)定；節(jié)約缺點：菌種易退化；易污染雜菌；營養(yǎng)物的利用率低應用：酵母菌單細胞蛋白（SCP）、乙醇、乳酸等發(fā)酵、污水處理微生物的高密度培養(yǎng)（HCDC）也稱高密度發(fā)酵，一般指微生物在液體培養(yǎng)基中細胞群體密度超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時的生長狀態(tài)或培養(yǎng)技術選取最佳培養(yǎng)基成分和各成分含量補料提高溶解氧的濃度防止有害代謝產物的生成高密度培養(yǎng)實例E.coli的高密度培養(yǎng)理論值：可達到200g(濕)/L～400g/L，即使為200g/L，則發(fā)酵液中菌體約占1/4，其流動性喪失E.coli的高密度培養(yǎng)報道值:PHB的工程菌為175.4g/L，W3110菌株菌值174g/L獲取HCDC必須綜合考慮與充分運用各菌株的生長繁殖的規(guī)律，以獲取最佳效果。溫度是影響微生物生長的最重要因素之一。溫度對微生物的影響具體表現(xiàn)在：影響酶活性，溫度變化影響酶促反應速率，最終影響細胞合成。影響細胞膜的流動性，溫度高，流動性大，有利于物質的運輸，溫度低，流動性降低，不利于物質運輸，因此，溫度變化影響營養(yǎng)物質的吸收與代謝產物的分泌。影響物質的溶解度，對生長有影響。一、溫度對微生物生長的影響第三節(jié)影響微生物生長的主要因素從微生物整體來看:生長的溫度范圍一般在-10℃—100℃極端下限為-30℃，極端上限為105—300℃但對于特定的某一種微生物：只能在一定溫度范圍內生長，在這個范圍內，每種微生物都有自己的生長溫度三基點，即最低、最適、最高生長溫度處于最適生長溫度時，生長速度最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物不生長，溫度過低，甚至會死亡。超過最高生長溫度，微生物不生長，溫度過高，甚至會死亡。（一）微生物生長的三個溫度基點根據(jù)微生物的最適生長溫度的不同，可將微生物劃為三個類型：（二）微生物生長溫度類型低溫型微生物（嗜冷微生物）中溫型微生物（嗜溫微生物）高溫型微生物（嗜熱微生物）低溫型微生物:最適生長溫度在5~20℃主要分布在地球的兩極、冷泉、深海、冷凍場所及冷藏食品中。例：假單孢菌中的某些嗜冷菌在低溫下生長，常引起冷藏食品的腐敗。嗜冷微生物在低溫下生長的機理，目前還不清楚，據(jù)推測有兩種原因：①它們體內的酶能在低溫下有效地催化，在高溫下酶活喪失②細胞膜中的不飽和脂肪酸含量高，低溫下也能保持半流動狀態(tài)，可以進行物質的傳遞。中溫型微生物：最適生長溫度為20℃—40℃，大多數(shù)微生物屬于此類。室溫型主要為腐生或植物寄生，在植物或土壤中。體溫型主要為寄生，在人和動物體內。高溫型微生物：最適生長溫度為50℃—60℃,主要分布在溫泉、堆肥和土壤中。在高溫下能生長的原因：①酶蛋以及核糖體有較強的抗熱性②核酸具有較高的熱穩(wěn)定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成氫鍵，增加熱穩(wěn)定性）。③細胞膜中飽和脂肪酸含量高，較高溫度下能維持正常的液晶狀態(tài)。1、高溫對微生物的影響高溫下蛋白質不可逆變性，膜受熱出現(xiàn)小孔，破壞細胞結構（溶菌）?！镂⑸飳岬哪褪芰εc以下因素有關:(1)微生物種類及發(fā)育階段嗜熱菌比其它類型的菌體抗熱有芽孢的細菌比無芽孢的菌抗熱微生物的繁殖結構比營養(yǎng)結構抗熱性強老齡菌比幼齡菌抗熱（三）高溫與低溫對微生物的影響(2)微生物對熱的耐受力還受環(huán)境條件的影響與培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分有關——培養(yǎng)基中蛋白質含量高時比較耐熱.與pH有關——pH適宜時不易死亡，pH不適宜時，容易死亡.與水分有關——含水量大時容易死亡，含水量小時不容易死亡.與含菌量有關——含菌量高，抗熱性增強，含菌量低，抗熱性差。與熱處理時間有關——熱處理時間長，微生物易死亡。當環(huán)境溫度低于微生物的最適生長溫度時，微生物的生長繁殖停止，當微生物的原生質結構并未破壞時，不會很快造成死亡并能在較長時間內保持活力，當溫度提高時，可以恢復正常的生命活動。低溫保藏菌種就是利用這個原理。一些細菌、酵母菌和霉菌的瓊脂斜面菌種通常可以長時間地保藏在4℃的冰箱中。當溫度過低，造成微生物細胞凍結時，有的微生物會死亡，有些則并不死亡。2、低溫對微生物的影響造成死亡的原因：①凍結時細胞水分變成冰晶，冰晶對細胞膜產生機械損傷，膜內物質外漏。②凍結過程造成細胞脫水。凍結速度對冰晶形成有很大影響，緩慢凍結，形成的冰晶大，對細胞損傷大；快速凍結，形成的冰晶小、分布均勻，對細胞的損傷小，因此，利用快速凍結可以對一些菌種進行凍結保藏，一般情況下在菌懸液中再加一些甘油、糖、牛奶、保護劑等可對菌種進行長期保藏。

菌名 生長溫度 發(fā)酵溫度 累積產物溫度 （℃） （℃） （℃）

S.thermophilus(嗜熱鏈球菌）

37 47 37S.lactis(乳酸鏈球菌）

34 40 產細胞：25~30

產乳酸：30S.griseus(灰色鏈霉菌）

37 28 _Corenybacteriumpekinense 32 33~35 _Clostridiumacetobutylicum 37 33 _Peniciliumchrysogenum 30 25 20不同生理生化過程的最適溫度微生物不同生理活動要求不同溫度；最適生長溫度≠發(fā)酵速度快、積累代謝產物多。微生物對氧的需要和耐受力在不同的類群中變化很大，根據(jù)微生物與氧的關系,可把它們分為幾種類群:

專性好氧菌:好氧菌

微好氧菌：兼性厭氧菌耐氧厭氧菌：

厭氧菌

(專性)厭氧菌：二、氧氣對微生物生長的影響專性好氧菌：必須在有分子氧的條件下才能生長；細胞含有超氧物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶。絕大多數(shù)真菌、多數(shù)細菌和放線菌。兼性好氧菌：在有氧或無氧條件下均能生長，但有氧情況下生長得更好；細胞含有SOD和過氧化氫酶。許多酵母菌和不少細菌。微好氧菌：只能較低的氧分壓下才能正常生長?；魜y弧菌、發(fā)酵單胞菌屬、彎曲菌屬等。耐氧菌：生活不需要氧，分子氧也對它無毒害。細胞內存在SOD和過氧化物酶，但缺乏過氧化氫酶。乳酸菌多為耐氧菌。厭氧菌：分子氧對它有毒害。生命活動所需能量通過發(fā)酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵提供；細胞內缺乏SOD和細胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶。嚴格厭氧微生物并不是被氣態(tài)的氧所殺死，而是由于不能解除某些氧代謝產物的毒性而死亡。在氧還原為水的過程中，可形成某些有毒的中間產物，例如，過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2·

）等。超氧陰離子為活性氧，兼有分子和離子的性質，反應力極強，極不穩(wěn)定，可破壞膜和重要生物大分子，對微生物造成毒害或致死。厭氧菌的氧毒害機制—SOD學說：

H2O+O22O2·+2H+ O2+H2O2 2H2OO2+e

O2·

超氧陰離子在細胞內可由酶促或非酶促形成。超氧化物歧化酶（SOD）是在生物進化中發(fā)展出來的一種自我保護方式。生物體中超氧陰離子的形成與去除12SOD好氧生物和耐氧細菌過氧化氫酶好氧生物過氧化物酶NADH2 NAD耐氧菌在培養(yǎng)不同類型的微生物時，要采用相應的措施:培養(yǎng)好氧微生物：需振蕩或通氣，保證充足的氧氣。培養(yǎng)專性厭氧微生物：需排除環(huán)境中的氧氣，同時在培養(yǎng)基中添加還原劑，降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位勢。pH值對微生物的影響pH值表示水溶液中氫離子的負對數(shù)值。特點:微生物界適應pH的范圍極廣。三基點為:最低生長pH為1～2

最適生長pH為5～8

最高生長pH為9～10

pH值對微生物的影響同一種微生物在其不同的生長階段和不同的生理生化過程中，對pH值的要求也不同。微生物胞內酶的最適pH值一般為中性在發(fā)酵工業(yè)中，控制pH值尤其重要舉例：黑曲霉：pH2-2.5合成檸檬酸pH2.5-6.5菌體生長pH7.0合成草酸pH值對微生物的影響根據(jù)微生物生長的最適pH值，將微生物分為：嗜堿微生物：硝化細菌耐堿微生物：許多鏈霉菌中性微生物：絕大多數(shù)細菌，一部分真菌嗜酸微生物：硫桿菌屬耐酸微生物：乳酸桿菌、醋酸桿菌

微生物的生命活動對環(huán)境pH值的影響

分解糖類、脂肪等，產生酸性物質，pH↓分解蛋白質、尿素等，產生堿性物質，pH↑由于無機鹽選擇性吸收：銨鹽吸收（（NH4）2SO4

－H2SO4），pH↓硝酸鹽吸收（NaNO3

－NaOH），pH↑pH值對微生物的影響培養(yǎng)過程中調節(jié)pH值的措施過酸時：加入堿或適量氮源，提高通氣量。過堿時：加入酸或適量碳源，降低通氣量。

第四節(jié)微生物培養(yǎng)法概論微生物培養(yǎng)技術的發(fā)展從少量培養(yǎng)發(fā)展到大規(guī)模培養(yǎng)。從淺盤培養(yǎng)發(fā)展到厚層固體或深層（液體）培養(yǎng)。從以固體培養(yǎng)為主發(fā)展到以液體培養(yǎng)為主。從靜止式液體培養(yǎng)發(fā)展到通氣攪拌式液體培養(yǎng)。從分批培養(yǎng)發(fā)展到連續(xù)培養(yǎng)以至多級連續(xù)培養(yǎng)。從游離的微生物細胞培養(yǎng)發(fā)展到利用固定化細胞培養(yǎng)。從單一微生物培養(yǎng)發(fā)展到混合微生物培養(yǎng)。從利用野生菌種發(fā)展到利用變異菌株以及“工程菌”。從單菌發(fā)酵到混菌發(fā)酵。從低密度培養(yǎng)到高密度培養(yǎng)。從人工控制的發(fā)酵罐到多傳感器、計算機控制的自動化發(fā)酵罐。良好微生物培養(yǎng)裝置首要條件:提供豐富而均勻的營養(yǎng)物。物化條件:能保證微生物獲得適宜的溫度 和必需的良好通氣條件。必備裝置:嚴防雜菌污染的容器和場所。實驗室固體培養(yǎng)法（一）固體培養(yǎng)法好氧法：試管斜面、培養(yǎng)皿瓊脂平板、克氏扁瓶或茄子瓶等進行平板培養(yǎng)。厭氧法：高層瓊脂柱（韋榮氏管/Veillontube)、厭氧培養(yǎng)皿、厭氧罐技術、Hungate滾管法和厭氧手套箱等。厭氧培養(yǎng)中的三大件為：厭氧罐、Hungate滾管法和厭氧手套箱。Hungate滾管技術用高純氮驅除小環(huán)境中的空氣，使操作過程始終處于高度無氧的條件下，從而保證了厭氧菌的存活。將菌接種到融化的培養(yǎng)基中，然后將特制的試管用丁基橡膠塞嚴密后平放，置冰浴中均勻滾動，使含菌的培養(yǎng)基布滿在試管的內表面，最后長出許多單菌落。PRAS培養(yǎng)基：預還原無氧滅菌培養(yǎng)基。

（二）液體培養(yǎng)法

好氧菌的液體培養(yǎng)試管液體培養(yǎng)三角瓶淺層液體培養(yǎng)搖瓶培養(yǎng)臺式發(fā)酵罐第五節(jié)微生物生長繁殖的控制滅菌采用強烈的理化因素使任何物體內外部的一切微生物永遠喪失其生長繁殖能力的措施，稱為滅菌。滅菌還可分殺菌（菌體雖死、形體尚存）、溶菌（菌體被殺死后，細胞自溶、裂解消失）。消毒采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內部的一部分對人體有害的病原菌，而對被處理物體基本無害的措施，稱為消毒。防腐利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生長繁殖，從而達到防止物品發(fā)生霉腐的措施，稱為防腐?；熂椿瘜W治療。利用具有高度選擇毒力的化學物質抑制宿主體內病原微生物的生長繁殖，以達到治療該傳染病的一種措施。低溫：利用4℃以下的各種低溫以保藏食物、藥品、菌種等。缺氧：在密閉容器中加入除氧劑，如鐵粉。真空保藏也是比較常用的方法。干燥：采用曬干或紅外線干燥保藏糧食、食品等，或在密封條件下用吸濕劑也可達到防霉作用。高滲：通過鹽漬或糖漬達到高滲。高酸度：如泡菜、酸菜等。高醇度：用酒保存食品。防腐劑：苯甲酸、山梨酸、脫氫醋酸等。防腐的措施1、高溫滅菌（消毒）法—是最常用的物理方法。高溫可引起蛋白質、核酸等活性大分子氧化或變性失活而導致微生物死亡。

一常用的滅菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法（一）溫度★干熱滅菌法（dryheatsterilization）焚燒法（incineration）：是將被滅菌物品在火焰中燃燒，使所有的生物質碳化。簡單、徹底，但對被滅菌物品的破壞極大。干燥熱空氣滅菌法(hot-airoven)：將物品放入烘箱內，然后升溫至150℃—170℃，維持1—2小時。適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌，不適合液體樣品，及棉花、紙張、纖維和橡膠類物質的滅菌。特點：由于空氣傳熱穿透力差，菌體在脫水狀態(tài)下不易殺死，所以溫度高、時間長。

★濕熱法(moistheatsterilization)：特點：溫度低、時間短、滅菌效果高原因：1)蒸汽冷凝會放出潛熱；

2)飽和水蒸汽穿透力強；

3)濕熱易破壞細胞內蛋白質大分子的穩(wěn)定性，主要破壞氫鍵結構。高壓蒸汽滅菌法利用水的沸點隨水蒸氣壓力的增加而上升，以達到100℃以上高溫滅菌的方法。方法：121℃維持15-20min。

112℃維持20-30min。

115℃維持20-30min。應根據(jù)滅菌物品的性質或成分選擇滅菌溫度例如：生理鹽水用121℃。含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培養(yǎng)基用112℃。適用：耐高溫物品，玻璃儀器、含水或不含水的物品。

注意事項：排凈冷空氣；滅菌終了，緩慢降壓；滅菌結束，趁熱取出物品。高溫對培養(yǎng)基的影響及其防止措施高溫對培養(yǎng)基的不利影響：會產生混濁或形成不溶性沉淀營養(yǎng)成分被破壞（PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）；色澤加深（褐變如產生氨基糖等）；改變培養(yǎng)基的pH值（通常下降0.2）；形成有害物質，抑制微生物生長；消除有害影響的措施采用特殊的加熱滅菌法過濾除菌法（1）巴斯德消毒法低溫維持法：63℃，30min處理牛奶。高溫瞬時法：72℃，15s處理牛奶。（2）煮沸消毒法將水加熱至100℃，煮沸15min～30min，可殺死所有營養(yǎng)細胞和部分芽孢，達到消毒物品的目的。常壓法（3）間歇滅菌法：

將待滅菌物品在80-100℃蒸煮15-60min，冷卻后擱置室溫（28-37℃）下過夜，并重復以上過程三遍以上。其蒸煮過程可殺死微生物的營養(yǎng)體，但不能殺死芽胞，室溫過夜促使殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，再經(jīng)蒸煮過程可殺死新的營養(yǎng)體；循環(huán)三次以上可保證徹底滅菌的目的。適用于不耐高溫的物品滅菌，如不適于高壓滅菌的特殊培養(yǎng)基、藥品的滅菌。缺點是麻煩、費時。低溫—低溫是通過降低酶反應速度使微生物生長受到抑制。冷藏法：5℃，微生物斜面菌種放置冷藏箱中可保存數(shù)周至數(shù)月而不衰竭死亡；食品保鮮冷凍法：食品工業(yè)中采用-10℃左右的冷凍溫度較長時間地保藏食品；冷凍法也可用作菌種保藏，但所需溫度更低，如-80℃低溫冰箱、或-78℃干冰、或液氮中冷凍保存。2、低溫抑菌采用濾孔比細菌還小的篩子或濾膜作成各種過濾器，當空氣或液體流經(jīng)篩子或濾膜時，微生物不能通過濾孔而被阻留在一側，從而達到滅菌的目的。實驗室中常用的濾器：濾器孔徑：常用0.22μm、0.45μm。應用：對于含酶、血清、維生素和氨基酸等熱敏物質除菌。（二）過濾除菌法紫外線滅菌使用紫外燈照射，可以根據(jù)1W/M3來計算劑量，若以面積計算，一般30W的紫外燈可用于15M2的房間消毒，照射時間為20—30分鐘，有效照射距離為1米左右。γ射線滅菌Co60放射性元素可放出γ射線。（三）輻射化學殺菌劑、消毒劑和治療劑關于化學性試劑的藥效和毒性的指標

1、最低抑制濃度：評定某化學藥物藥效強弱的指標。指在一定的條件下，某化學藥劑抑制特定微生物的最低濃度。2、半致死量：評定某藥物毒性強弱的指標。指在一定條件下，某化學藥劑能殺死50%實驗動物時的劑量。3、最低致死量：指在一定條件下，某化學藥劑能引起實驗動物群體100%死亡率的最低劑量。消毒劑:對一切活細胞都有毒性，不能用作活細胞內或機體內治療用的化學藥劑。主要用于抑制或殺滅物體表面、器械、排泄物和環(huán)境中的微生物。如皮膚、粘膜、傷口等處防止感染。消毒防腐劑的作用機理①使微生物蛋白質凝固變性，發(fā)生沉淀。如酒精等；②破壞菌體的酶系統(tǒng)，影響菌體代謝。如過氧化氫等；③降低微生物表面張力，增加細胞膜的通透性，使細胞發(fā)生破裂或溶解。如來蘇兒等酚類物質。表面消毒劑

消毒劑殺菌的規(guī)律低濃度時，會對微生物的生命活動起刺激作用，隨濃度的增加，相繼出現(xiàn)抑菌和殺菌作用，因而形成一個連續(xù)的作用譜表面消毒劑的相對殺菌強度——石炭酸系數(shù)（P.C.）在一定時間內，被試藥劑殺死全部供試菌的最高稀釋度與達到同效的石炭酸最高稀釋度之比。時間：10min、供試菌：Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）如：P.C.=300/100=3

類型

名稱及使用方法

作用原理

應用范圍

醇類70%—75%乙醇脫水、蛋白質變性皮膚、器皿

醛類0.5%—10%甲醛2%戊二醛（pH=8）蛋白質變性房間、物品消毒（不適合食品廠）

酚類3%—5%石炭酸2%來蘇兒3%—5%來蘇兒破壞細胞膜、蛋白質變性地面、器具皮膚地面、器具氧化劑0.1%高錳酸鉀3%過氧化氫0.2%—0.5%過氧乙酸氧化蛋白質活性基團，酶失活皮膚、水果、蔬菜皮膚、物品表面水果、蔬菜、塑料等常用的消毒防腐劑及其應用（1）

常用的消毒防腐