發(fā)酵工藝學(xué)課件：第八章 微生物工程下游技術(shù)

第八章微生物工程下游技術(shù)原料液中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度一般都很低，如L-異亮氨酸濃度為2.4％，青霉素為3.6％，慶大霉素為0.2％，胰島素僅為0.001％。原料液中成分復(fù)雜，常存在與目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)極其相似的分子及異構(gòu)體。當(dāng)生物技術(shù)產(chǎn)品是食品或藥物時，溶劑的使用受到一定的限制，萃取、色譜等手段會受到一定的限制。發(fā)酵液成分一般不穩(wěn)定。原料液特點發(fā)酵液放罐后，應(yīng)及時快速操作，原因在于

1.菌體可能自溶

2.容易被雜菌污染

3.引起產(chǎn)物的破壞和降解。原料液中常存在降解目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)，如可水解目標(biāo)蛋白質(zhì)的蛋白酶。下游技術(shù)可分為4個階段，即預(yù)處理、提取、精制、成品制作。下游技術(shù)一般工藝過程

預(yù)處理→細(xì)胞分離→細(xì)胞破壁(胞內(nèi)產(chǎn)物)加熱過濾勻漿法調(diào)pH離心研磨法絮凝膜分離酶解法碎片分離→提取→精制→成品制作離心沉淀(重)結(jié)晶濃縮雙水相吸附干燥膜分離萃取色譜分離無菌過濾超濾膜分離結(jié)晶原料液細(xì)胞分離(離心，過濾)細(xì)胞－胞內(nèi)產(chǎn)物路線一路線二細(xì)胞破碎碎片分離路線一A路線一B清液－胞外產(chǎn)物粗分離(鹽析、萃取、超濾等)純化(層析、電泳)脫鹽(凝膠過濾、超濾)濃縮(超濾)精制(結(jié)晶、干燥)包含體溶解(加鹽酸胍、脲)復(fù)性第一節(jié)發(fā)酵液預(yù)處理1、降低黏度加水稀釋：簡單，增體積、降低產(chǎn)物濃度。加熱升溫：檸檬酸發(fā)酵，90℃，蛋白質(zhì)變性凝固，利于過濾2、凝聚、絮凝改變粒子分散狀態(tài)，形成大顆粒，利過濾凝聚與絮凝凝聚與絮凝處理過程就是將化學(xué)藥劑預(yù)先投加到懸浮液中，改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進(jìn)行分離。凝聚和絮凝凝聚：指在投加的化學(xué)物質(zhì)（鋁、鐵鹽類）作用下，使膠體體系不穩(wěn)定并使粒子相互聚集成１mm大小塊狀凝聚體的過程。絮凝：指使用高分子絮凝劑將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用。常用絮凝劑聚丙烯酰胺類：用量少，絮凝體粗大，分離效果好，絮凝速度快，適用范圍廣。無機高分子聚合物天然有機高分子絮凝劑，如殼聚糖和葡聚糖等聚糖類，還有明膠、骨膠、海藻酸鈉等。微生物絮凝劑是近年來研究和開發(fā)的新型絮凝劑，由微生物產(chǎn)生的具有絮凝細(xì)胞功能的物質(zhì)。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纖維素及核酸等高分子物質(zhì)。微生物絮凝劑和天然絮凝劑與化學(xué)合成的絮凝劑相比，最大的優(yōu)點是安全，無毒和不污染環(huán)境。3、調(diào)整PH4、加入反應(yīng)劑環(huán)絲氨酸發(fā)酵液，氯化鈣、磷酸鹽生成沉淀。高價無機離子的去除Ca2+草酸Mg2+三聚磷酸鈉Fe3+黃血鹽（普魯士藍(lán)）蛋白質(zhì)去除加熱調(diào)pH(草酸，無機酸或堿)蛋白質(zhì)的變性最常用的使蛋白質(zhì)變性的方法是加熱。加熱還能使液體粘度降低，加快過濾速度。鏈霉素生產(chǎn)中，采用調(diào)pH至酸性（pH3.0），加熱至70℃，維持半個小時的方法來去除蛋白質(zhì)，能使過濾速度增大10-100倍，濾液粘度可降低1/6。第二節(jié)過濾、細(xì)胞破碎、結(jié)晶陶瓷濾膜一、過濾二、離心高速冷凍離心機旋轉(zhuǎn)過濾機滾筒式離心機4000細(xì)胞破碎（cellrupture）技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)。細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型藥物成分的基礎(chǔ)。三、細(xì)胞破碎

一些蛋白質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)時被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，其后續(xù)分離和純化都相對簡單。但由于一些重組DNA產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜，必須在細(xì)胞內(nèi)組裝來獲得生物活性，如果在培養(yǎng)時被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，其生物活性往往有所改變，此類產(chǎn)品是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)品（非分泌型），需要應(yīng)用細(xì)胞破碎技術(shù)破碎細(xì)胞，使重組的藥物成分釋放出來，為后續(xù)的分離純化做好準(zhǔn)備工作。1.酶消化法

細(xì)胞懸浮液中加入酶能迅速和細(xì)胞壁反應(yīng)并破壞它們。酶選擇性的與細(xì)胞壁反應(yīng)，不破壞細(xì)胞內(nèi)的其它物質(zhì)。反應(yīng)條件溫和。此法的缺點在于酶的消耗限制了在大規(guī)模生產(chǎn)中的使用。

2.機械法

勻漿法研磨法超聲波法：利用頻率高、波長短的超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎，效率更高高壓均質(zhì)法細(xì)胞破碎儀四、結(jié)晶

1.結(jié)晶的特點（1）只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有良好的選擇性。（2）通過結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會留在母液中，再通過過濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。（3）結(jié)晶過程具有成本低、設(shè)備簡單、操作方便，廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。2.結(jié)晶過程

(1)過飽和溶液的形成

(2)晶核生成

(3)晶體的生長3.常用的工業(yè)起晶方法（1）自然起晶法：（2）晶種起晶法：5.重結(jié)晶

經(jīng)過一次粗結(jié)晶后，得到的晶體通常會含有一定量的雜質(zhì)。此時工業(yè)上常常需要采用重結(jié)晶的方式進(jìn)行精制。重結(jié)晶是利用雜質(zhì)和結(jié)晶物質(zhì)在不同溶劑和不同溫度下的溶解度不同，將晶體用合適的溶劑再次結(jié)晶，以獲得高純度的晶體。重結(jié)晶的操作過程

（1）選擇合適的溶劑；（2）將經(jīng)過粗結(jié)晶的物質(zhì)加入少量的熱溶劑中，并使之溶解；（3）冷卻使之再次結(jié)晶；（4）分離母液；（5）洗滌進(jìn)入生長期的青蒿生長旺期的青蒿收獲青蒿青蒿素分離精制方法

采用恒溫振蕩浸提法提取，活性炭脫色，75%(v/v)乙醇重結(jié)晶。提取的青蒿素精制的青蒿素分離實例——西地蘭毛花毛地黃干燥葉粉70%乙醇熱提三次醇提液減壓濃縮至含乙醇20%，放冷膠狀沉淀（葉綠素等雜質(zhì)）稀醇液減壓濃縮至無醇味濃水液氯仿洗滌氯仿液濃水液加乙醇至22%稀醇液水液氯仿液氯仿萃取三次氯仿液回收氯仿殘留物少量CH3OH與水混合苷結(jié)晶甲醇-氯仿-水分配氯仿層(主要是苷A、B)水層濃縮結(jié)晶(苷B、C)甲醇-氯仿-水分配水層氯仿層(苷B)水層濃縮，過濾結(jié)晶(苷C)溶于乙醇，加Ca(OH)2減壓濃縮，結(jié)晶結(jié)晶(苷C)甲醇重結(jié)晶西地蘭純品第三節(jié)膜分離Membraneseparation是利用特殊制造的、具有選擇透過性能的膜，在外力推動下對混合物進(jìn)行分離、提純、濃縮的一種分離方法。

根據(jù)質(zhì)量、體積和幾何形態(tài)差異進(jìn)行分離。如過濾、微濾和超濾。3.1膜分離概述膜分離的特點①分離效能高。②膜分離過程都不發(fā)生相變，能耗低。③膜分離過程的工作溫度在室溫附近，膜分離設(shè)備本身沒有運動的部件，結(jié)構(gòu)緊湊、維修費用低，易于自動化。④設(shè)備體積小，占地少。⑤膜分離可直接插入已有的生產(chǎn)工藝流程。

膜分離存在的問題①在操作中膜面會發(fā)生污染，使膜性能降低；②膜的耐壓性、耐熱性、耐溶劑是有限的，故應(yīng)用范圍受限制；③僅采用膜分離技術(shù)分離效果有限，往往需要與其他分離工藝組合起來使用。按膜孔徑大小分類微濾膜0.02～10μm超濾膜0.001～0.02μm（1～20nm）反滲透膜0.0001～0.001μm（0.1～1nm）納米過濾膜平均直徑2nm。3.2膜原理0.5μm0.5μm3μm20μm膜的電鏡照片中空纖維超濾膜結(jié)構(gòu)單內(nèi)皮層雙皮層膜污染的處理與再生用物理方法清洗化學(xué)清洗方法①起溶解作用的物質(zhì)：酸、堿、酶（蛋白酶）、螯合劑、表面活性劑、分散劑。②起切斷離子結(jié)合作用的方法：改變離子強度、pH、電位。③起氧化作用的物質(zhì)：過氧化氫、次氯酸鹽。3.3膜組件的結(jié)構(gòu)和特點

管式膜組件tubularmembranemodule平板膜組件

平板膜組件結(jié)構(gòu)

parallel-platemembranemodule

螺旋卷式膜組件

螺旋卷式膜組件結(jié)構(gòu)

spiral-woundmembranemodule3.4膜分離在生物工程中的的應(yīng)用各種膜分離法的原理和應(yīng)用范圍膜分離法傳質(zhì)推動力應(yīng)用舉例微濾

壓差0.05～0.5MPa除菌，回收菌超濾

壓差0.1～1.0MPa蛋白質(zhì)、多糖的回收和濃縮反滲透

壓差1.0～10MPa鹽、氨基酸、糖的濃縮濃縮大分子純化去雜質(zhì)（植物成分）去熱原過濾除菌小分子產(chǎn)物的回收氨基酸、抗生素、有機酸和動物疫苗等發(fā)酵產(chǎn)品的相對分子質(zhì)量在2000以下，用超濾法可從發(fā)酵液中回收這些小分子產(chǎn)物，然后利用反滲透法進(jìn)行濃縮和除去更小的雜質(zhì)。除內(nèi)毒素內(nèi)毒素是細(xì)菌新陳代謝和細(xì)菌死后分解的產(chǎn)物，主要成分是脂多糖、脂蛋白等。在靜脈注射藥液時，如果將其帶進(jìn)血液，會對人體造成相當(dāng)大的危害。傳統(tǒng)的針劑用水除內(nèi)毒素的方法是過濾加活性炭吸附，此法并不可靠。在醫(yī)藥工業(yè)上用超濾法制造無菌水。蛋白質(zhì)的回收與脫鹽根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量，選擇適當(dāng)?shù)某瑸V膜，可進(jìn)行蛋白質(zhì)的濃縮和脫鹽。藥酒和中藥制劑的澄清滲透蒸發(fā)

是液體混合物在膜的一側(cè)與膜接觸，其中易滲透組分較多地溶解在膜上，并擴散通過膜，在膜的另一側(cè)氣化而被抽出，從而得到分離的過程。滲透蒸發(fā)的過程原理第四節(jié)其他常用操作技術(shù)一、濃縮加熱、真空抽出料液中的水中藥濃縮罐。除去一些水。不同顏色管道不同功能。黑紅色為蒸汽，藍(lán)色為料液。二、凍干三、噴霧干燥多級萃取多級錯流萃取流程

多級逆流萃取流程

1.1％葡聚糖水溶液與等體積0.36％甲基纖維素鈉水溶液相混合并靜置后，可得到兩個粘稠液層。

4.2雙水相萃取

利用親水性高分子聚合物的水溶液可形成雙水相的性質(zhì)，開發(fā)了雙水相萃取法(twoaqueousphaseextraction)廣泛應(yīng)用的雙水相體系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dex)體系。聚合物與無機鹽的混合溶液，例如，PEG/磷酸鉀、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等常用于生物產(chǎn)物的雙水相萃取。雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用

雙水相萃取技術(shù)目前較多地應(yīng)用于胞內(nèi)酶的提取和精制上。用雙水相萃取技術(shù)處理細(xì)胞勻漿液，既可方便地除去細(xì)胞碎片，還可使酶得到精制。在雙水相體系中，通常將目的蛋白質(zhì)分配在上相(PEG)，而細(xì)胞碎片分配在下相(鹽)。1.過濾設(shè)備的分類

根據(jù)推動力的不同可分為四類（a）重力過濾 自然過濾（b）加壓過濾 板框過濾（c）真空過濾 真空過濾器（d）離心過濾 離心過濾器2.過濾介質(zhì)1、無定形顆粒：活性炭顆粒、沙、無煙煤2、成形顆粒：燒結(jié)金屬、燒結(jié)塑料3、非金屬織物：尼龍、玻璃纖維4、金屬織物：不銹鋼絲網(wǎng)5、無紡品：紙、石棉板框壓濾機板框壓濾機優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單、過濾面積大、操作壓力高、適用廣缺點：設(shè)備笨重、間歇操作、勞動強度大、輔助時間長對于一些固體顆粒小、溶液粘度大的體系，過濾實際上是很難進(jìn)行的，必須采用離心技術(shù)方能達(dá)到目的。二、離心操作方式：間歇式、連續(xù)式型式：管式、套筒離心沉降利用懸浮液或乳濁液中密度不同的組分在離心力場中迅速沉降分層，實現(xiàn)固液分離溶液中的溶質(zhì)在一定條件下，因分子有規(guī)則的排列而結(jié)合成晶體，晶體的化學(xué)成分均一，其特征為離子和分子在空間晶格的結(jié)點上呈規(guī)則的排列.四、結(jié)晶

1.結(jié)晶的特點（1）只有同類分子或離子才能排列成晶體，因此結(jié)晶過程有良好的選擇性。（2）通過結(jié)晶，溶液中大部分的雜質(zhì)會留在母液中，再通過過濾、洗滌，可以得到純度較高的晶體。（3）結(jié)晶過程具有成本低、設(shè)備簡單、操作方便，廣泛應(yīng)用于氨基酸、有機酸、抗生素、維生素、核酸等產(chǎn)品的精制。2.結(jié)晶過程

(1)過飽和溶液的形成

(2)晶核生成

(3)晶體的生長

過飽和溶液的形成方法(1)冷卻(2)溶劑蒸發(fā)(3)改變?nèi)軇┬再|(zhì)3.晶體的生長

在過飽和溶液中已有晶核形成或加入晶種后，以過飽和度為推動力，晶核或晶種將長大，這種現(xiàn)象稱為晶體生長。提高晶體質(zhì)量的方法

（1）晶體質(zhì)量包括三個方面的內(nèi)容：晶體大小、形狀、純度（2）影響晶體純度的因素：母液中的雜質(zhì)、結(jié)晶速度、晶體粒度及粒度分布

4.常用的工業(yè)起晶方法（1）自然起晶法：（2）晶種起晶法：5.重結(jié)晶

經(jīng)過一次粗結(jié)晶后，得到的晶體通常會含有一定量的雜質(zhì)。此時工業(yè)上常常需要采用重結(jié)晶的方式進(jìn)行精制。重結(jié)晶是利用雜質(zhì)和結(jié)晶物質(zhì)在不同溶劑和不同溫度下的溶解度不同，將晶體用合適的溶劑再次結(jié)晶，以獲得高純度的晶體。重結(jié)晶的操作過程

（1）選擇合適的溶劑；（2）將經(jīng)過粗結(jié)晶的物質(zhì)加入少量的熱溶劑中，并使之溶解；（3）冷卻使之再次結(jié)晶；（4）分離母液；（5）洗滌3.1膜分離概述膜的定義：在一種流體相間有一薄層凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔開來成為兩部分，這一薄層物質(zhì)稱為膜膜還必須具有高度的滲透選擇性膜的性能參數(shù)

孔道特征包括孔徑（poresize）、孔徑分布和孔隙度?？讖椒植迹╬oresizedistribution）是指膜中一定大小的孔的體積占整個孔體積的百分?jǐn)?shù)?？紫抖龋╡ffectivenumberofpores）是指整個膜中孔所占的體積百分?jǐn)?shù)。水通量：水通量為每單位時間內(nèi)通過單位膜面積的水體積流量，也叫透水率，即水透過膜的速率。單內(nèi)皮層中空纖維超濾膜結(jié)構(gòu)菌體分離對于發(fā)酵的胞外產(chǎn)物，首先要除去懸浮的微生物、離子與膠體。目前，較好的固液分離方法是過濾或離心。采用超濾法去除谷氨酸發(fā)酵液中的菌體，不僅可以將發(fā)酵原液中固形物含量濃縮10倍，為菌體的再利用創(chuàng)造了條件；而且超濾透過液中谷氨酸含量、pH等理化指標(biāo)與發(fā)酵液相同，但不含菌體，且蛋白含量很低