喜樹堿類抗抑瘤藥物的研究進(jìn)展

喜樹堿類抗抑瘤藥物的研究進(jìn)展

吉樹堿藥物可以阻止異構(gòu)酶i的恢復(fù)效果，這是近年來引起世界關(guān)注的腫瘤藥物研究的一個(gè)新方向。這是20世紀(jì)90年代使用的三種抗腫瘤藥物。但隨著喜樹堿類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用,出現(xiàn)了對(duì)喜樹堿及其衍生物耐藥甚至對(duì)其他抗腫瘤藥物交叉耐藥的腫瘤細(xì)胞,嚴(yán)重影響了喜樹堿類藥物的開發(fā)和應(yīng)用。本文就喜樹堿類藥物的作用機(jī)理、耐藥機(jī)制及可能的逆轉(zhuǎn)途徑的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。1雙鏈dna的超螺旋復(fù)制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomeraseⅠ,TopoⅠ)是生物體內(nèi)廣泛存在的一類必需酶,參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等所有關(guān)鍵的核過程,是細(xì)胞生存的必需酶。人TopoI為單體酶,是由765個(gè)氨基酸組成的分子量約為91KD的蛋白質(zhì),定位于第20號(hào)染色體。正常情況下,雙鏈DNA處于一種高度卷曲的超螺旋狀態(tài),在進(jìn)行復(fù)制時(shí),這種高度卷曲的超螺旋狀態(tài)首先需要解旋,然后才能通過堿基配對(duì),完成DNA的復(fù)制。解旋的工作就是由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶來完成的。TopoI能使雙鏈DNA產(chǎn)生短暫的單鏈斷裂,并與之形成TopoI-DNA共價(jià)中間物而使超螺旋DNA松馳化,然后再將切斷的單鏈DNA連接起來,此時(shí)超螺旋DNA解旋,酶從DNA上分離開來,解旋后的DNA更容易進(jìn)入轉(zhuǎn)錄裝置,然后進(jìn)一步進(jìn)行復(fù)制。多種腫瘤細(xì)胞TopoI的含量遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞,是選擇性抗腫瘤藥物的理想作用靶點(diǎn)。2藥物與cpt的相互作用喜樹堿(camptothecin,CPT)主要來源于我國特有的植物珙桐科喜樹,1966年由Wall等首次從我國引種的喜樹干中分離得到,并最早報(bào)道其具有抗癌活性。但直到1985年,Hsiang等揭示了喜樹堿抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TopoI)的新作用機(jī)制,該藥才引起了國內(nèi)外醫(yī)藥界的極大重視,并成為世界性研究熱點(diǎn)。目前已經(jīng)上市并用于臨床抗癌治療的喜樹堿類藥物有拓?fù)涮婵?TPT)、伊立替康(CPT-11)、10-羥基喜樹堿(HCPT)等,其中伊立替康為前藥,在體內(nèi)羧酯酶的作用下,轉(zhuǎn)化成為高活性的代謝物SN-38。喜樹堿類藥物導(dǎo)致細(xì)胞死亡的直接原因是由于其S期細(xì)胞毒活性,使細(xì)胞終止在G2期。前面提到,TopoI可以與DNA形成一種可裂解的二元復(fù)合物TopoI-DNA,使DNA解旋,同時(shí)在DNA聚合酶的作用下進(jìn)行復(fù)制,正常情況下,解旋與復(fù)制的速度是一致的。而CPT能與TopoI中的親核部分相互作用,與TopoI-DNA斷裂復(fù)合物可逆結(jié)合,形成藥物-TopoI-DNA三元復(fù)合物,這種三元復(fù)合物是可逆的,本身并不會(huì)引起細(xì)胞的死亡,但CPT能穩(wěn)定可裂解的復(fù)合物,繼而抑制了DNA缺口的修復(fù)。當(dāng)復(fù)制叉(replicationfork)運(yùn)動(dòng)到此處時(shí),與CPT-TopoI-DNA三元復(fù)合物發(fā)生碰撞,由此造成復(fù)制過程的阻滯,DNA雙鏈的斷裂,且藥物與斷裂復(fù)合物的結(jié)合由可逆轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡?從而最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。處于S期的細(xì)胞DNA大量復(fù)制,與拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑遭遇形成DNA復(fù)合體的機(jī)會(huì)增多,從而使DNA斷裂點(diǎn)增多導(dǎo)致對(duì)喜樹堿類藥物誘導(dǎo)的凋亡最為敏感,約比G1或G2期細(xì)胞敏感1000倍。3喜樹堿類藥物作用特性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的多藥耐藥問題是近年來研究的熱點(diǎn)之一,癌癥患者對(duì)化療耐藥常常是治療失敗的重要原因。其耐藥機(jī)制主要包括:(1)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活化,如P-糖蛋白,能將細(xì)胞內(nèi)藥物排出細(xì)胞外;(2)藥物活性減低或者藥物的解毒作用增強(qiáng),如谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GSTπ);(3)化療藥物作用靶點(diǎn)的改變或損傷靶點(diǎn)的修復(fù)增強(qiáng),如TopoIIα;(4)細(xì)胞凋亡的抑制和細(xì)胞周期的停滯,如P53、Bcl-2;等。隨著喜樹堿類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用,出現(xiàn)了對(duì)喜樹堿及其衍生物耐藥甚至對(duì)其他抗腫瘤藥物交叉耐藥的腫瘤細(xì)胞,嚴(yán)重影響了喜樹堿類藥物的開發(fā)和應(yīng)用。目前,對(duì)TopoI抑制劑耐藥機(jī)理及相關(guān)因素尚未闡明,大致可歸納如下:3.1耐藥p-gp的機(jī)制在許多腫瘤細(xì)胞膜上存在著結(jié)構(gòu)功能特異的跨膜蛋白,其依賴ATP供能,將化療藥物泵出到胞外,導(dǎo)致臨床耐藥。這些膜蛋白統(tǒng)稱為ABC(ATP-bindingcassette)蛋白家族,包括最早發(fā)現(xiàn)的P-gp、多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)以及乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)等。P-gp是分子量為170KD,由mdrl基因編碼,引起多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,CPT類藥物引起的耐藥是否與P-gp相關(guān),目前還存在爭(zhēng)議。Hendricks等研究表明P-gp過度表達(dá)所導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降是腫瘤細(xì)胞對(duì)喜樹堿類抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的重要原因,增加P-gp的調(diào)節(jié)劑喹啉丁或維拉帕米可使喜樹堿類藥物積聚和細(xì)胞毒作用增加。但也有學(xué)者認(rèn)為,在喜樹堿類抗腫瘤藥物耐藥的人卵巢癌或乳腺癌細(xì)胞中,藥物高度耐藥與P-gp無關(guān)。Doyle等首先在米托蔥醒(MX)誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞中檢測(cè)到BCRP的表達(dá),將其命名為BCRP或MXR或ABCP,它是由655個(gè)氨基酸組成的分子量為72.6KD的蛋白質(zhì),定位于4q22染色體。大量研究顯示腫瘤細(xì)胞BCRP過表達(dá)是CPT產(chǎn)生耐藥的主要原因。BCRP主要定位于細(xì)胞膜上,在胎盤、中腦、毛細(xì)血管內(nèi)皮等高表達(dá),參與屏障保護(hù)作用。BCRP其功能與P-gp相似能在ATP供能狀態(tài)下將有害物質(zhì)泵出細(xì)胞外以保護(hù)細(xì)胞免受損害,僅在20min內(nèi),卵巢癌耐藥株中被泵出到胞外的CPT超過90%。在TPT和MX直接篩選的卵巢癌耐藥細(xì)胞株中,胞內(nèi)TPT的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于親本細(xì)胞,且伴隨著BCRP的過表達(dá),而無P-gp、MRP的過表達(dá),TopoI的表達(dá)水平也無變化。這說明TPT藥物濃度降低是由于BCRP的泵出作用所致。此外,TianQ等報(bào)道MRP4的高表達(dá)也與喜樹堿等化療藥物的耐藥性密切相關(guān)。3.2關(guān)于引發(fā)tpt耐藥的點(diǎn)近年來的研究證實(shí),TopoI上氨基酸殘基的突變是導(dǎo)致喜樹堿耐藥性產(chǎn)生的重要原因之一。應(yīng)用x衍射技術(shù)分析藥物-TopoI-DNA三元復(fù)合物,發(fā)現(xiàn)TopoI基因的722位密碼子AAU突變?yōu)锳GU后,編碼的天冬酰氨酸突變?yōu)榻z氨酸,影響了TopoI與TPT的內(nèi)酰胺環(huán)羰基的結(jié)合而參與TPT耐藥。TopoI是TopoI抑制劑的作用靶點(diǎn),所以腫瘤細(xì)胞表達(dá)TopoI含量越高,TopoI抑制劑的胞毒作用越強(qiáng),反之亦然。另有研究發(fā)現(xiàn)在TPT耐藥的NYH/TPT細(xì)胞中,TopoI含量較親代細(xì)胞減低50%。3.3免疫藥物維持治療后細(xì)胞中ndp-核糖基化的活性研究發(fā)現(xiàn),一些耐藥株DNA修復(fù)能力提高,多ADP-核糖聚合酶(PARP)是一種豐富的核酶,它的活性對(duì)DNA修復(fù)是十分必要。DNA損傷可強(qiáng)烈刺激PARP的活性,導(dǎo)致各種與核染色質(zhì)聯(lián)系的蛋白如組蛋白H1、DNA連接酶II、Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶、RNA聚合酶II、TopoI、TopoII及PARP自身的多ADP-核糖基化,從而修復(fù)損傷的DNA而產(chǎn)生耐藥。另有資料顯示腫瘤細(xì)胞內(nèi)羧酸酯酶的活性降低,可引起伊立替康向其活性形式SN-38的轉(zhuǎn)化受阻,從而導(dǎo)致對(duì)伊立替康耐藥。此外,原癌基因c-erbB-2的過度復(fù)制、表達(dá)和基因突變也與喜樹堿等化療藥物的耐藥性有關(guān),并可作為預(yù)測(cè)化療敏感性的指標(biāo)。4吉樹堿藥的耐藥性的逆轉(zhuǎn)4.1與其他化療藥配伍TopoI抑制劑單獨(dú)用藥療效欠佳,且易產(chǎn)生耐藥。由于TopoI抑制劑耐藥細(xì)胞株多不對(duì)其他化療藥產(chǎn)生交叉耐藥,故通過不同機(jī)制的化療藥物配伍,如與TopoII抑制劑、TAX、鉑類、烷基抗癌藥等聯(lián)合應(yīng)用可提高療效并避免或減少耐藥的產(chǎn)生。4.2cpt的藥物代謝逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一,越來越多的學(xué)者特別關(guān)注胞內(nèi)藥物聚集減少所引起的CPT耐藥,由于大量研究顯示腫瘤細(xì)胞BCRP過表達(dá)是CPT產(chǎn)生耐藥的主要原因,因此逆轉(zhuǎn)BCRP藥物外排泵作用機(jī)制已成為研究的CPT耐藥熱點(diǎn)。P-gP抑制劑GF120918可有效提高耐藥株的胞內(nèi)CPT濃度而逆轉(zhuǎn)P-gP及BCRP介導(dǎo)的耐藥,口服CPT同時(shí)口服GF120918,可使CPT的血漿生物利用度約增加6倍,大大提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)CPT的敏感性。真菌毒素(FTC)也是有效的BCRP抑制劑,但FTC的神經(jīng)毒性限制了其臨床應(yīng)用,而FTC的類似物Ko143不但有更強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)作用,而且不產(chǎn)生毒性作用。雌激素及其拮抗劑通過降低BCRP蛋白表達(dá),增強(qiáng)TPT在細(xì)胞內(nèi)聚集而逆轉(zhuǎn)BCRP介導(dǎo)的耐藥。此外,Yang等發(fā)現(xiàn)新生霉素也能逆轉(zhuǎn)BCRP高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞對(duì)拓?fù)涮婵档哪退帯?.3植物基因型采用網(wǎng)絡(luò)冷卻劑和中藥逆轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的研究近年來,中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)喜樹堿耐藥的研究日漸增多,中藥逆轉(zhuǎn)優(yōu)勢(shì)在于:毒副作用小、作用靶點(diǎn)多,某些中藥成分逆轉(zhuǎn)作用強(qiáng);中藥在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的同時(shí),往往還具有抗腫瘤及調(diào)節(jié)免疫等功能,更能提高對(duì)腫瘤的整體治療水平。最多見的方法是根據(jù)按現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)逆轉(zhuǎn)耐藥的研究成果,挖掘中藥逆轉(zhuǎn)劑,如從食物及植物中提取的類黃酮類物質(zhì)如genistein、naringenin及acacetin等植物雌激素均可降低BCRP的表達(dá),從而逆轉(zhuǎn)BCRP過表達(dá)引起的細(xì)胞耐藥,并增強(qiáng)SN-38對(duì)k562/BCRP的細(xì)胞毒性,使伊立替康在細(xì)胞內(nèi)蓄積增加。從白芨的莖中提取出來的Stilbenoids可在轉(zhuǎn)導(dǎo)了BCRP的k562細(xì)胞株(k562/BCRP)中增強(qiáng)SN-38的細(xì)胞毒性,而逆轉(zhuǎn)喜樹堿耐藥。但目前尚沒有一個(gè)中藥逆轉(zhuǎn)劑在臨床大規(guī)模實(shí)驗(yàn),亟待拓展新的研究思路和方法指導(dǎo)中醫(yī)藥逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥研究并開發(fā)出新的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的中藥制劑。4.4抗基因微胞術(shù)基因治療可以增加耐藥細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性,并且具有較強(qiáng)的特異性和無毒性,為腫瘤耐藥的逆轉(zhuǎn)開辟了嶄新的途徑,優(yōu)化了化學(xué)治療,因而具有廣闊的應(yīng)用前景。EePL等將siRNA轉(zhuǎn)染人絨毛膜癌細(xì)胞株后能顯著降低細(xì)胞BCRP表達(dá)并使細(xì)胞對(duì)拓?fù)涮婵档拿舾行苑謩e增加了10.5和8.2倍。運(yùn)用互補(bǔ)于耐藥基因轉(zhuǎn)錄起始部位的反義寡聚脫氧核糖核酸傳染表達(dá)耐藥基因的細(xì)胞株后,也能明顯提高耐藥細(xì)胞株對(duì)藥物的敏感性。研究表明單克隆抗體5D3可在細(xì)胞膜表面與BCRP結(jié)合,抑制BCRP向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)藥物,為逆轉(zhuǎn)耐藥提供了一條新思路。另有資料顯示表達(dá)核酶的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)化耐藥腫瘤細(xì)胞后也