臨床分離耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥機制研究

臨床分離耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥機制研究

銅綠假單胞菌（pae）是一種廣泛分布于自然界和健康人的皮膚、腸道和呼吸道。在正常情況下，它不會感染人體的任何組織。然而，如果身體的免疫水平降低，嚴重傷口和醫(yī)療操作后，它可能會感染大多數(shù)人體的組織。臨床可表現(xiàn)為局部化膿性炎癥和全身性感染,常常危及患者的生命。亞胺培南(IMP)為碳青酶烯類藥物,是一種新型的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,其抗菌譜廣,對革蘭陰性和革蘭陽性菌、需氧菌、厭氧菌皆有很強的抗菌活性。藥物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),亞胺培南對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定(含ESBLs、AmpC酶),與青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)親和力強,并能夠有效滲透細菌外膜進入周質(zhì)間隙,具殺菌活性強大等特點,被認為是目前控制臨床感染性疾病最為有效的藥物之一,但隨著廣泛使用和過度使用,其耐藥性也逐漸增加。因此,我們分析了我院34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌(IMPRPAE)對常用抗菌藥物的耐藥特點,并從碳青酶烯酶、金屬酶產(chǎn)生,膜微孔蛋白丟失以及細胞內(nèi)主動外排泵表型特征3個方面,對其耐藥機制進行了研究,現(xiàn)總結(jié)報道如下。1菌株鑒定及藥敏試驗方法1.1菌株來源與質(zhì)控菌株34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌來自于2005年1-12月我院住院患者臨床分離的標本(包括痰液、尿液、傷口分泌物、膿液、血液等)。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922。1.2主要儀器設(shè)備與試劑Eppendorfcentrifuge5417R低溫離心機,恒溫金屬浴(杭州大和),MJPeltierThermalCycler(MJResearch),Bio-Rad電泳儀,Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng),瓊脂糖(英國Oxoid公司),100bpDNA梯帶標志物(大連寶生物),6×加樣(loading)緩沖液(北京天為時代),氰氯苯腙(CCCP)終濃度5mg/L(Sigma),IMPEtest試條(0.002~32μg/ml)(瑞典ABBiodisk)M-H培養(yǎng)基(杭州天和),頭孢哌酮/舒巴坦藥敏紙片(英國Oxoid公司)。1.3菌株鑒定及藥敏試驗方法所有菌株均以BDPhoenix100全自動微生物分析儀鑒定到種,必要時采用ATB或傳統(tǒng)生化方法補充鑒定。藥敏試驗采用BDPhoeni×100配套藥敏試驗復(fù)合板,包括阿米卡星、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢他啶、氯霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、左氧氟沙星、美羅培南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、四環(huán)素、復(fù)方新諾明共16種抗菌藥物,頭孢哌酮/舒巴坦采用K-B法。模板DNA提取,采用蛋白酶K消化法。1.4基因擴增oprD2基因熱循環(huán)參數(shù)為93℃預(yù)變性3min→93℃30s→55℃30s→72℃60s,最后一個72℃延伸5min,共循環(huán)35周期。其余基因熱循環(huán)參數(shù)為:93℃預(yù)變性3min→93℃60s→55℃60s→72℃60s,最后一個72℃延伸5min,共循環(huán)35周期。純水為陰性對照。耐藥基因檢測試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。應(yīng)用PCR方法,引物序列見表1。1.5結(jié)果判斷取10μl擴增產(chǎn)物與2μl6×上樣緩沖液混勻,點樣于1.5%瓊脂糖凝膠,在100V電壓電泳30min,出現(xiàn)目的條帶即為檢測基因陽性,用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。1.6CCCP對主動外排泵表型特征的影響配制水解酪蛋白(M-H)瓊脂和含CCCP(終濃度5mg/L,該濃度對外排泵有較好抑制作用,而對細菌生長無影響)的M-H瓊脂平皿,挑取2~3個過夜培養(yǎng)的菌落,用生理鹽水調(diào)至0.5麥氏單位,按照K-B法標準操作程序涂布菌懸液和貼Etest試條,放35℃培養(yǎng)24h,觀察CCCP對IMP的MIC的逆轉(zhuǎn)作用。當(dāng)存在CCCP時IMP的MIC比缺乏時相應(yīng)的MIC下降至原值的1/4,提示主動外排機制存在。2ccp存在對imp體外抗菌活性的影響2.1耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥特點IMPRPAE除對阿米卡星100%敏感、對哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦較敏感,敏感率48%~55%;對其余β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素、磺胺類抗菌藥物耐藥嚴重,結(jié)果見表2。2.2耐藥基因檢測結(jié)果34株IMPRPAE中,檢測到IMP陽性6株,陽性率17.6%,oprD2基因缺失1株,陽性率2.9%,其余耐藥基因(VIM、GIM、SPM、OXA-10、GES)未檢出。耐藥基因電泳結(jié)果見圖1、2。2.3CCCP存在與否對IMP體外抗菌活性的影響34株IMPRPAE中,CCCP存在使IMPMIC下降至4個濃度梯度的菌株有4株,占11.8%;下降至3個濃度梯度的菌株有4株,占11.8%;下降至2個濃度梯度的菌株有5株,占14.7%;其余的菌株在CCCP存在與否IMP的MIC值無變化,占61.7%。提示IMPRPAE對IMP主動外排的耐藥機制占11.8%。3碳青酶烯類抗菌藥物的耐藥機制近10多年來,由于廣譜頭孢菌素及碳青酶烯類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,細菌耐藥率有增長趨勢,特別是多重耐藥和IMPRPAE是臨床抗感染治療的難點之一,倍受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。我院2005年1-12月分離的34株IMPRPAE除對阿米卡星敏感(敏感率100%)外,哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦對PAE有較強的抗菌活性,敏感率48%~54%;三代、四代頭孢菌素、氨曲南、喹諾酮類等抗菌藥物抗菌活性差,敏感率為3%~29%。對美羅培南敏感的有29%,提示PAE對亞胺培南和美羅培南的耐藥機理不盡相同。34株IMPRPAE對氯霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素全部耐藥。因此,應(yīng)重視和加強細菌耐藥監(jiān)測,合理應(yīng)用和優(yōu)先選用低耐藥可能性的抗菌藥物,將有助于控制細菌耐藥,避免IMPRPAE引起醫(yī)院感染流行。銅綠假單胞菌因其固有和獲得性耐藥,對IMP的耐藥機制比較復(fù)雜,通常包括產(chǎn)酶、膜孔蛋白丟失、泵出機制、生物膜形成、青霉素結(jié)合蛋白改變等多種機制。碳青酶烯酶是能夠明顯水解碳青酶烯類抗菌藥物的一類β-內(nèi)酰胺酶,它包括Ambler分子分類為A、B、D類3類酶,其中B類為金屬酶,屬Bush分類中的3組,是PAE耐碳青酶烯類抗菌藥物的主要β-內(nèi)酰胺酶,可由染色體、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子介導(dǎo)。目前發(fā)現(xiàn)的獲得性金屬酶包括IMP、VIM、GIM、SPM4種,以IMP和VIM常見。D類β-內(nèi)酰胺酶即OXA酶(OXA-23~-27)常見于不動桿菌屬,國外已在PAE中發(fā)現(xiàn)多種OXA型酶基因,國內(nèi)相關(guān)報道較少,蔣曉飛等曾報道在8株多重耐藥PAE中檢出blaoxa-10型基因(同時還存在blaveb-1基因),諸葛青云等從28株IMPRPAE中檢出1株blaoxa-10型基因。A類酶是青霉素酶,對亞胺培南的水解活性強于美羅培南,可引起青霉素類、氨曲南和碳青酶烯類耐藥,第三代頭孢菌素敏感,他唑巴坦、克拉維酸可以抑制此類酶,主要見于一些腸桿菌科細菌以及肺炎克雷伯菌,銅綠假單胞菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的GES-2是2000年首次在南非發(fā)現(xiàn),南非在一次由產(chǎn)GES-2型酶的銅綠假單胞菌引起的暴發(fā)流行死亡率達62.5%。本研究中IMP陽性菌株占17.6%,未檢測到其他金屬酶和碳青酶烯酶,提示產(chǎn)IMP型金屬酶是PAE對IMP耐藥的機制之一。oprD分為D1和D2,研究發(fā)現(xiàn)與亞胺培南耐藥有關(guān)的為外膜孔蛋白(OprD2),銅綠假單胞菌外膜蛋白孔道是小分子的亞胺培南選擇性快速進入菌體的特異性通道,也允許帶有陽性電子基團的各種糖類及堿性氨基酸非特異擴散。OprD2蛋白是目前所知的PAE外膜中惟一有助于抗菌藥物通透的孔道蛋白,具有配體特異性,不僅能形成亞胺培南的特異結(jié)合位點,同時發(fā)現(xiàn)堿性氨基酸為亞胺培南的競爭性抑制劑。其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均不能通過OprD2通道,所以碳青酶烯類抗菌藥物與其他β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物無交叉耐藥性。一般認為OprD2缺失是PAE對IMP耐藥的主要機制,但本研究oprD2基因缺失占2.9%,與國內(nèi)外相關(guān)報道差別較大,提示oprD2基因缺失不是本組IMPRPAE耐藥的主要原因,但不排除因oprD2基因突變或基因表達下調(diào)導(dǎo)致PAE對IMP耐藥,后續(xù)研究正在進行中。PAE細胞膜上的主動外排蛋白是導(dǎo)致PAE對多種抗菌藥物表現(xiàn)固有或獲得性多重耐藥的原因,這些蛋白包括控制抗菌藥物進出細胞的外膜通道蛋白、轉(zhuǎn)運抗菌藥物的內(nèi)膜蛋白和膜連接蛋白。PAE細胞膜上的這些主動外排蛋白組成了主動外排系統(tǒng),主要有MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM4種,其中MexAB-OprM最為重要。OprM表達過度可導(dǎo)致對青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類、碳青酶烯類、喹諾酮類、氯霉素、磺胺類藥物耐藥。CCCP為質(zhì)子泵抑制劑的代表制劑,能破壞細菌跨胞漿膜的質(zhì)子梯度,導(dǎo)致轉(zhuǎn)運蛋白失去能量供應(yīng)而起作用。一般認為CCCP作用使IMPRPA