山楂葉總黃酮對糖尿病腎病大鼠腎臟gf-

山楂葉總黃酮對糖尿病腎病大鼠腎臟gf-

糖尿病和腎病是糖尿病最常見、最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥之一，嚴重威脅著人類的健康。因此，有必要確定影響糖尿病和腎臟的有效方法和方法。目前西醫(yī)防治糖尿病腎病中,藥物副作用較大,因此我國廣泛開展了中醫(yī)中藥對糖尿病腎病的防治研究。本實驗以山楂葉總黃酮干預(yù)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型大鼠,觀察山楂葉總黃酮對大鼠腎臟TGF-β1/Smad4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。1材料和方法1.1syxk6-400選用正常Wistar大鼠60只,雌雄各半,體質(zhì)量(200±20)g,由黑龍江省佳木斯大學(xué)動物中心提供,合格證號:(黑)SYXK2006-004。1.2試劑及儀器山楂葉總黃酮:晉城中晉藥業(yè)有限公司,批號20071229;厄貝沙坦:賽諾非安萬特(杭州)制藥有限公司。鏈脲佐菌素:美國Sigma公司;RT-PCR試劑盒及相關(guān)輔助試劑:南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;引物合成:北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。血糖儀及試紙:美國強生公司;梯度PCR儀(Gradient型,Biometra公司);GIS凝膠成像分析系統(tǒng)(TanonGIS-1000)。1.4測試指標(biāo)1.4.1血液測試1.4.224小時尿蛋白測定1.4.3血液中蛋白質(zhì)和素氮的測定1.4.4病理形態(tài)觀察1.5統(tǒng)計分析2結(jié)果2.1小鼠肝腎組織結(jié)構(gòu)變化模型組血糖明顯升高,腎功能下降,經(jīng)山楂葉總黃酮治療后血糖下降,腎功能改善。光鏡下正常組腎小球結(jié)構(gòu)完整,腎小球毛細血管基底膜、系膜、基質(zhì)未見明顯異常,腎小管形狀規(guī)則,未見肥大。模型組可見腎小球肥大,毛細血管基底膜增厚,系膜細胞增生,系膜區(qū)增寬,基質(zhì)增多,腎小球細胞外基質(zhì)的相對面積明顯增大。腎小管擴張,上皮細胞腫脹空泡變性。各治療組較模型組均有不同程度改善,山楂葉總黃酮組與陽性組腎小球細胞外基質(zhì)的相對面積無明顯差異(見表2)。2.2模型組表達不同的表達,模型組表達不同正常組大鼠腎組織可見TGF-β1、Smad4mRNA的表達,模型組的表達均明顯增加。經(jīng)山楂葉總黃酮治療后大鼠腎組織TGF-β1、Smad4mRNA的表達均明顯減少,山楂葉總黃酮組與陽性組無明顯差異(見表3)。3山楂葉總黃酮對糖尿病腎病大鼠腎組織病理學(xué)的作用許多研究表明TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,因此靶向TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尋找有效的治療藥物具有重要的臨床和現(xiàn)實意義。山楂葉總黃酮具有改善心功能,增強心肌抵抗缺氧能力;降低血壓、血脂;降糖;強大的抗氧化等作用。本實驗結(jié)果表明山楂葉總黃酮可顯著降低24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮,改善腎組織的病理變化。提示山楂葉總黃酮對糖尿病腎病模型大鼠具有明顯的腎保護作用。糖尿病時高血糖、糖基化終末產(chǎn)物、血管緊張素II等都可以激活TGF-β1,它是一種多功能,能多向調(diào)節(jié)的細胞因子,是糖尿病腎病復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)中心的核心因子TGF-β1激活后與其受體結(jié)合,其受體復(fù)合物通過Smads蛋白將信號由細胞膜直接轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi),誘導(dǎo)腎小球以及腎小管細胞肥大,促進腎小球細胞外基質(zhì)積聚,抑制腎小球細胞外基質(zhì)降解,從而引起腎間質(zhì)纖維化,其中Smad4在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起瓶頸作用,是調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子,是TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中必不可少的家族成員。本實驗應(yīng)用RT-PCR法測定腎臟TGF-β1、Smad4的表達,結(jié)果顯示山楂葉總黃酮可以下調(diào)TGF-β1、Smad4的表達,通過影響TGF-β1/Smad4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,阻斷糖尿病腎病大鼠腎臟中TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的腎小球細胞外基質(zhì)積聚、腎小球肥大、腎小管上皮細胞的轉(zhuǎn)分化以及腎間質(zhì)的纖維化,從而減輕糖尿病腎病的病理改變,改善腎功能。1.3各組大鼠腎組織病理學(xué)檢測大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,除正常組外其余所有大鼠喂高脂高糖飼料4周后,按25mg/kg一次性尾靜脈注射2%鏈脲佐菌素注射劑,實驗9周后測空腹血糖和24h尿蛋白(UPr)。取空腹血糖≥16.8mmol/L的大鼠重新分組,正常組正常飼料喂養(yǎng),模型組、陽性組及山楂葉總黃酮組高脂高糖飼料喂養(yǎng),陽性組厄貝沙坦氯化鈉溶液3g/(kg·d),山楂葉總黃酮組山楂葉總黃酮200mg/(kg·d)固定時間灌胃給藥,共12周。內(nèi)眥靜脈取血測血糖?？捡R斯亮藍法測定。殺死大鼠前心腔穿刺取血,4℃離心分離血清,-20℃保存測定血肌酐、尿素氮。腎組織在10%甲醛中固定24h,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋。常規(guī)病理切片,分別行HE、PAS染色,光鏡下觀察腎組織病理變化,PAS染色切片分析、計算腎小球細胞外基質(zhì)(ECM)的相對面積。分離各組大鼠腎皮質(zhì),腎皮質(zhì)總RNA提取按Trizol說明書進行。5μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA,以此為模板分別用β-actin、TGF-β1、Smad4引物經(jīng)PCR方法