5-fu胃癌多藥耐藥細(xì)胞株的建立及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

5-fu胃癌多藥耐藥細(xì)胞株的建立及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

對(duì)幽門(mén)腫瘤的藥物類抗劑的抗劑已成為失敗的重要原因之一。結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受性與多種因素有關(guān)，死亡抑制在腫瘤細(xì)胞藥物的形成中起著重要作用。為了研究胃癌耐藥機(jī)制,本研究以臨床最常用的胃癌化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)誘導(dǎo)低分化胃腺癌細(xì)胞株BGC823建立起胃癌多藥耐藥細(xì)胞株BGC823/5-FU,并以此為模型,檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白生存素(Survivin)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表達(dá)變化,探討胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥的機(jī)制。材料和方法1試劑和儀器RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco;新生小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma。Survivin、Bcl-2、Bax、caspase-3抗體購(gòu)自SantaCruz。5-FU購(gòu)自天津金輝氨基酸有限公司;阿霉素(ADM)購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;絲裂霉素C(MMC)購(gòu)自KyowaHakkoKogyo;順鉑(DDP)購(gòu)自山東齊魯制藥廠;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。流式細(xì)胞儀(FACScan,BD),酶標(biāo)儀(Model850,Bio-Rad)。2方法和步驟2.1耐藥細(xì)胞培養(yǎng)人胃低分化腺癌細(xì)胞株BGC823購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。BGC823細(xì)胞于含青霉素100U/L、鏈霉素100mg/L,10%新生牛血清RPMI-l640完全培養(yǎng)液中置37℃、5%CO2、全濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。采用反復(fù)大劑量沖擊結(jié)合逐步遞增藥物濃度法,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC823細(xì)胞,加入5mg/L5-FU,于37℃、5%CO2、全濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h,用不含Ca2+、P3-的磷酸鹽緩沖液D-Hanks洗1次,將細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)藥RPMI-1640完全培養(yǎng)液中,待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后,反復(fù)用5-FU沖擊處理,同時(shí)逐漸增加藥物濃度,經(jīng)過(guò)8次沖擊至5-FU藥物濃度達(dá)40mg/L,建立其耐藥細(xì)胞株BGC823/5-FU。待細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)后將其維持培養(yǎng)于含5-FU10mg/L的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中,每2-3d傳代1次。撤藥2周后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。2.2耐藥計(jì)數(shù)測(cè)定收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC823及BGC823/5-FU細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×108cells/L。將細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組與空白組,每組設(shè)3個(gè)平行孔。取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi),100μL/well,孵育24h后再分別加入8個(gè)倍比稀釋濃度梯度的5-FU、ADM、MMC和DDP,調(diào)整每孔終體積至200μL;以不加化療藥物組作為對(duì)照組;僅加入200μLRPMI-1640完全培養(yǎng)液為空白組。96孔培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72h后,每孔加入MTT(5g/L)20μL,繼續(xù)孵育4h后,2000r/min離心10min,棄上清。每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO),酶標(biāo)儀上以570nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度(A)值。取3個(gè)平行孔的平均A值計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A平均值/對(duì)照組A平均值)×100%;以藥物濃度對(duì)數(shù)為橫軸,生存率為縱軸,做出量-效曲線,求得半數(shù)抑制率(IC50),計(jì)算耐藥倍數(shù)。耐藥倍數(shù)RF=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50。2.3p-gp抗體法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的耐藥細(xì)胞BGC823/5-FU和其親本細(xì)胞BGC823,PBS洗凈后分別加人FITC標(biāo)記的P-gp抗體40μL,混勻,避光,4℃孵育30min。PBS終止反應(yīng),離心1000r/min,4℃離心5min,棄上清,PBS洗2次。流式細(xì)胞儀采用488nm激發(fā)波長(zhǎng),檢測(cè)FITC熒光強(qiáng)度,Cell-quest軟件進(jìn)行分析。2.4dnr組的體外反應(yīng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的耐藥細(xì)胞BGC823/5-FU和其親本細(xì)胞BGC823,加入含DNR2mg/L的培養(yǎng)液約3mL,另設(shè)不加DNR組作為對(duì)照組。分別于37℃孵育60min后,棄去培養(yǎng)液,胰蛋白酶消化30s,加入預(yù)冷的PBS約2mL中止反應(yīng)。4℃1000r/min離心5min,棄上清液,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)為495nm,發(fā)射波長(zhǎng)為590nm處檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNR的自發(fā)熒光強(qiáng)度,Cell-quest軟件進(jìn)行分析。2.5蛋白質(zhì)提取與凝膠電泳收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC823及BGC823/5-FU細(xì)胞,細(xì)胞裂解液(50mmol/LTris·ClpH6.8、100mmol/L二硫蘇糖醇、2%SDS、0.1%溴酚藍(lán)、10%甘油)裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì),Bradford法進(jìn)行蛋白定量,每孔上樣蛋白量20μg,上樣容量40μL,進(jìn)行SDS凝膠電泳。180mA轉(zhuǎn)膜120min后,用封閉液封閉硝酸纖維素膜,室溫下振蕩1h,以相應(yīng)抗體進(jìn)行雜交,ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行顯色,X光片壓片后顯影、定影。利用Investigator-HTPCAnalyzer軟件觀察分析結(jié)果,QuantityOne吸光度分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。3統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果1細(xì)胞的耐藥性MTT法檢測(cè)BGC823/5-FU細(xì)胞相對(duì)于BGC823細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為10.82倍,此細(xì)胞對(duì)各類臨床常用化療代表藥物ADM(蒽環(huán)類)、MMC(抗生素類)和DDP(鉑類)也分別具有2.5、22.23、2.0倍的耐藥性,見(jiàn)表1。2u細(xì)胞p-gp表達(dá)水平流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明,BGC823/5-FU細(xì)胞P-gp表達(dá)水平為(71.52±1.60)%,顯著高于其親本細(xì)胞BGC823細(xì)胞(5.90±0.89)%,P<0.01,見(jiàn)圖1。3各組bcg2c23/5-sf細(xì)胞內(nèi)柔激素表達(dá)水平比較流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明,以不加DNR的親本細(xì)胞BGC823即陰性對(duì)照組為2.57±0.11,BGC823/5-FU細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素濃度為52.54±1.20,明顯低于BGC823細(xì)胞209.19±4.92,P<0.01,見(jiàn)圖2。4westernb生長(zhǎng)量檢測(cè)BGC823/5-FU細(xì)胞與BGC823細(xì)胞Survivin、Bcl-2、Bax、caspase-3的Westernblotting檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3與表2(內(nèi)參照為β-Tubulin)。與BGC823細(xì)胞相比,BGC823/5-FU細(xì)胞Survivin表達(dá)上升(P<0.05);Bcl-2表達(dá)升高(P<0.05);Bax表達(dá)下降(P<0.05);caspase-3表達(dá)減低(P<0.05)?？沟蛲龌钚曰衔镌隗w外建立腫瘤耐藥細(xì)胞系是研究腫瘤耐藥的良好模型。主要有兩種方法,一種是將藥物敏感的腫瘤細(xì)胞維持培養(yǎng)于含化療藥物的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐藥性,另一種是將敏感腫瘤細(xì)胞間歇短期暴露于較高濃度抗腫瘤藥物中誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞耐藥,后者較好地模擬了臨床病人體內(nèi)反復(fù)間歇運(yùn)用抗腫瘤藥物的過(guò)程。人低分化胃腺癌細(xì)胞株BGC823由我國(guó)胃腺癌患者胃大彎處切除的組織經(jīng)處理后建株,但針對(duì)5-FU的BGC823耐藥細(xì)胞株的建立及其耐藥機(jī)制的研究均未見(jiàn)報(bào)道。我們應(yīng)用反復(fù)大劑量沖擊法結(jié)合逐步遞增5-FU藥物濃度法建立耐藥細(xì)胞株BGC823/5-FU,該耐藥細(xì)胞株較其親代細(xì)胞BGC823對(duì)5-FU的耐藥性分別提高10.82,同時(shí)它還對(duì)阿霉素、絲裂霉素和順鉑的耐藥性分別提高2.50、22.23和2.00倍。我們檢測(cè)了耐藥細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。P-糖蛋白是多藥耐藥基因1(MDR1)表達(dá)產(chǎn)物,為一種分子量為170kD的跨膜糖蛋白,它能通過(guò)水解ATP獲得能量,主動(dòng)將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外,從而使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降,藥物抗腫瘤效應(yīng)因此減弱甚至消失,表現(xiàn)出對(duì)藥物的耐受現(xiàn)象。柔紅霉素(daunorubicin,DNR)具有結(jié)合P-gp并被其外排的特性,因此,可根據(jù)此特性測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNR的含量來(lái)間接反映P-gp的功能。本研究顯示,與BGC823細(xì)胞比較,BGC823/5-FU細(xì)胞P-gp的表達(dá)有顯著上升,而B(niǎo)GC823/5-FU細(xì)胞積累DNR的能力下降。表明P-gp及其介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)藥物外排參與BGC823/5-FU細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制。目前認(rèn)為凋亡受抑在腫瘤細(xì)胞的耐藥中發(fā)揮著重要的作用。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中的抗凋亡和前凋亡蛋白,它們主要在內(nèi)源性凋亡途徑的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用。Bcl-2通過(guò)線粒體途徑參與凋亡調(diào)控,且Bcl-2/Bax比值決定了細(xì)胞對(duì)凋亡因子的敏感性。bcl-2基因表達(dá)下調(diào)可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡,bcl-2基因高表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,降低對(duì)藥物的敏感性。Caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)通路和化療藥物誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵蛋白,Bcl-2和Bax最終通過(guò)誘導(dǎo)caspase家族的釋放導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究顯示BGC823/5-FU細(xì)胞較BGC823細(xì)胞Bcl-2表達(dá)升高,Bax和caspase-3表達(dá)下降,這表明抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax和凋亡標(biāo)志蛋白caspase-3與BGC823/5-FU細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的新成員,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子,主要表達(dá)于人未分化成熟組織以及多種腫瘤細(xì)胞中。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Survivin主要是通過(guò)caspase的活性來(lái)參與細(xì)胞凋亡的抑制,Survivin還可協(xié)同Bcl-2發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。有研究表明胃癌組織SurvivinmRNA的表達(dá)明顯高于正常胃組織,胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的Survivin的表達(dá)明顯高于未轉(zhuǎn)移者,這提示Survivin與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而Survivin在胃癌多藥耐藥細(xì)胞BGC823/5-FU中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),與BGC823細(xì)胞