健康年齡女性和細(xì)菌性陰道病患者陰道菌群的比較

健康年齡女性和細(xì)菌性陰道病患者陰道菌群的比較

細(xì)菌陰道感染（bv）是女性最常見的陰道感染之一。它可能會(huì)導(dǎo)致毛發(fā)膜羊膜炎、胎盤早期破裂、早產(chǎn)、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、子宮切除術(shù)后陰道段感染、妊娠高血壓、妊娠高血壓、子宮切除后陰道感染和并發(fā)癥，并增加hiv缺乏的風(fēng)險(xiǎn)。目前治療BV的主要藥物是抗生素,復(fù)發(fā)率高。盡管經(jīng)過了50多年的醫(yī)學(xué)研究,其病因及發(fā)病機(jī)制仍不詳,普遍認(rèn)為是陰道內(nèi)正常菌群失調(diào)所致的一種混合感染。由于陰道菌群多為厭氧菌,營(yíng)養(yǎng)要求苛刻,使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法很難全面地認(rèn)識(shí)正常和病態(tài)的陰道菌群分布。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,尤其是第二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn),使得微生物組學(xué)的研究更加全面和準(zhǔn)確,但由于成本、測(cè)序通量及準(zhǔn)確性等原因尚未能夠?yàn)槿澜缪芯课⑸锷鷳B(tài)(如16Spyrosequencing法)所普遍采用。BarcodedPaired-EndIlluminaSequencing(簡(jiǎn)稱BIPES)操作簡(jiǎn)便,成本低廉,重現(xiàn)性好,可獲得全面、系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)化的微生物群落結(jié)構(gòu)信息,為益生菌及益生元在治療BV的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本研究利用其對(duì)健康育齡期女性和BV患者的陰道菌群進(jìn)行分析。1材料和方法1材料表面1.1主試劑1.2研究主題1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)均為2012年1月～3月在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科門診的患者,共37例,年齡20～45歲。納入標(biāo)準(zhǔn):Amsel臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的4項(xiàng)內(nèi)容:①稀薄均質(zhì)的陰道分泌物粘附于陰道壁,但易于擦下;②陰道pH大于4.5;③在陰道分泌物中見到線索細(xì)胞(cluecell);④氨氣味試驗(yàn)陽性,其中以發(fā)現(xiàn)線索細(xì)胞為必備項(xiàng)目+其他3項(xiàng)中的任意2項(xiàng)陽性,同時(shí)Nugent評(píng)分≥7分診斷為BV。1.2.2陰道混合物質(zhì)中去血等質(zhì)性分級(jí)為同期本院健康門診體檢育齡期婦女,共37例,年齡在20～45歲之間。通過詳細(xì)病史詢問、陰道清潔度分級(jí)、陰道分泌物Nugent評(píng)分,納入標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)滿足以下3項(xiàng):①無臨床癥狀;②陰道清潔度分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí);③Nugent評(píng)分在0～3分。兩組均為我國(guó)漢族人,同時(shí)滿足以下條件:患者1月內(nèi)無全身應(yīng)用抗生素及陰道局部用藥史,3d內(nèi)無性生活史,非妊娠期、哺乳期或月經(jīng)期,無糖尿病,沒有同時(shí)患有滴蟲性、霉菌性陰道炎或其它陰道炎。2方法2.1女性陰道混合物16srrna知情同意后,用無菌陰道棉拭子于陰道穹窿取分泌物,避免接觸到陰道口和外陰部以防污染。將拭子放入無菌干燥試管中,用于提取16SrRNA基因。健康育齡期女性陰道分泌物樣本編號(hào)為H1、H2、……H37;細(xì)菌性陰道病患者陰道分泌物樣本編號(hào)為BV1、BV2、……BV37。2.2總dna提取和檢測(cè)采用試劑盒提取樣本總DNA,具體操作步驟參照說明書。提取的總DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后于4℃保存?zhèn)溆谩?.31pcr擴(kuò)增條件以樣本總DNA為模版,采用引物967F:CNACGCGAAGAACCTTANC和1046R:CGACAGCCATGCANCACCT擴(kuò)增其中的16srRNAV6區(qū)基因。PCR反應(yīng)體系(25μl):10×buffer(2.5μl),dNTP(2μl),Mg2+(1.5μl),P1(0.5μl),P2(0.5μl),Ex-taq(0.25μl)模板DNA(1μl),H2O(16.75μl)。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2min,然后94℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸30s,共30個(gè)循環(huán),72℃最終延伸5min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。混合的PCR產(chǎn)物使用QiagenQIAquickGelExtractionKit切膠回收純化后,通過IlluminaHiSeq2000平臺(tái)進(jìn)行雙末端100bp測(cè)序(華大基因,深圳)。2.4分析測(cè)試方法測(cè)得序列經(jīng)過barcodedIlluminapaired-end(PE)sequencing(BIPES)程進(jìn)行初步處理。去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)(測(cè)序質(zhì)量較低者);反向互補(bǔ)組裝V6序列(比較不同的組裝策略);根據(jù)barcode將序列分拆到對(duì)應(yīng)樣品,去除barcode;切除引物序列,再次去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)(引物不匹配、含N、過短序列);使用TSC進(jìn)行聚類,提取出每個(gè)操作分類單元(OTU)的代表序列后利用GAST進(jìn)行物種的分類,其中屬于乳酸菌屬的OTU利用megablast進(jìn)一步分到種級(jí)別,后續(xù)分析包括聚類分析,Alpha多樣性和Beta多樣性分析?；赨nifrac距離,采用QIIME進(jìn)行陰道菌群主成分分析。采用lineardiscriminantanalysis(LDA)coupledwitheffectsizemeasurements(LEfSe)在線工具分析BV患者特殊的陰道菌群。3結(jié)果3.1之間質(zhì)控前后樣品的拼接質(zhì)控本實(shí)驗(yàn)測(cè)序樣品數(shù)74個(gè),共獲得132653條序列,經(jīng)過BIPES程序拼接質(zhì)控之后所得序列數(shù)為126910條序列,平均每個(gè)樣品1715條。3.2陰道菌群的形成通過稀釋曲線比較兩類樣品的Alpha多樣性,分析顯示BV患者的陰道菌群稀釋曲線明顯比正常組陡峭,提示其菌群多樣性較健康育齡期女性明顯增加。再進(jìn)一步使用了兩組多樣性指數(shù),分別是ObservedOTU和Shannon,來比較H組和BV組的陰道菌群的Alpha多樣性。ObservedOTU指數(shù)主要受到樣品物種豐富度的影響,而Shannon指數(shù)同時(shí)受到物種豐富度和均度兩者的影響。無論是豐富度指數(shù)還是Shannon指數(shù),H組和BV組的陰道菌群均出現(xiàn)顯著性差異(IndependentSamplesTtest,P<0.001)。3.3陰道菌群聚類分析我們采用QIIME分析流程,采用UniFrac來進(jìn)行beta多樣性分析。該方法展示菌群之間的相似度。每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)個(gè)體的菌群整體,而點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離通過兩個(gè)菌群之間的序列相似度比較獲得。PCoA分析顯示,無論是基于unweightedUnifrac距離還是weightedUnifrac距離,BV患者的陰道菌群與健康育齡期女性的菌能顯著分開,進(jìn)一步說明二者的菌群結(jié)構(gòu)有明顯的區(qū)別。為了比較H組與BV組陰道菌群樣品的相似性,我們進(jìn)一步利用primer6.0對(duì)H組與BV組陰道菌群樣品進(jìn)行聚類。H組陰道菌群聚在一起,相似度大于90%;BV組陰道菌群聚在一起,相似度約為50%,個(gè)體差異較大(圖3);兩組相似度只有不到10%,表明他們的菌群結(jié)構(gòu)相差甚遠(yuǎn)。這與圖2看到的聚類結(jié)果是相一致的。3.4bv患者乳酸桿菌檢測(cè)在菌屬的水平上,H組中相對(duì)豐度最高的是乳酸桿菌,約占95%甚至更高,在乳酸桿菌種的水平上,大部分人以L.iners(21例)、L.crispatus(12例)為主,或兩者相當(dāng)(4例),少部分人還存在少量的Ljensenii、L.gasseri,后面兩種在所有檢測(cè)對(duì)象中,均未占據(jù)主要地位,而是和前兩種共存。除了乳酸桿菌,部分正常女性陰道分泌物內(nèi)可見少量Gardnerella、Granulicatella、Streptococcus、Prevotella、Escherichia和其它菌屬。BV患者乳酸桿菌明顯減少,其相對(duì)比例從45%到1%(24例),以L.iners為主,部分患者(6例)甚至未檢出,但有患者(7例)仍是以乳酸桿菌占優(yōu)勢(shì),相對(duì)比例從75%～50%,其乳酸桿菌菌種不同于H組,是L.gasseri、L.acidophilus為主,或兩者并存,同時(shí)存在少量的L.iners和其它菌種。除了乳酸桿菌,Gardnerella、Granulicatella、Prevotella、Parvimonas、Dialister、Escherichia、Peptostreptococcus、Anaerococcus、Streptococcus、Peptoniphilus、Mobiluncus、Klebsiella增多。35例患者檢測(cè)出Gardenerlla,相對(duì)比例1%～95%,Granulicatella(14例),相對(duì)比例2%～30%,Prevotella(19例),Sneathia(34例),Dialister(25例),Parvimonas(24例),Peptpstreptococcus(23例),Anaerococcus(33例),Streptococcus(2例),它們與乳酸桿菌一起相對(duì)豐度約占98%。3.5lacterity分工LeFSe是新開發(fā)的新統(tǒng)計(jì)方法,適用于尋找微生物群落標(biāo)志物。圖4中不同的顏色分別表示在兩類樣品中各自富集的分類單元。分析顯示Gardnerella、Coriobacteriaceae、Prevotella、Granulicatella、Lachnospiroceae、Anaerococcus、Parvimonas、Peptoniphilus.harei、Peptostreptococcus、Dialister、Fusobacteriales在BV組顯著增加,而L.iners與正常相關(guān)性明顯。4對(duì)bv的和女同性陰道產(chǎn)品中l(wèi).crispalus的檢測(cè)本研究在Solexa測(cè)序平臺(tái)的基礎(chǔ)上,采用條碼技術(shù),通過配對(duì)雙末端測(cè)序策略(BIPES)測(cè)定16SrRNAV6區(qū)的方法對(duì)正常女性及Amsel標(biāo)準(zhǔn)篩選的BV患者陰道菌群進(jìn)行檢測(cè),借助通用引物深度測(cè)序,可以發(fā)現(xiàn)低豐度細(xì)菌或未知細(xì)菌,進(jìn)而可全面、準(zhǔn)確地獲得陰道菌群的信息。本研究顯示健康育齡期女性乳桿菌是陰道優(yōu)勢(shì)菌,約占95%甚至更高,它的分離率高達(dá)100%,不同于既往研究,其單獨(dú)以L.iners或L.crispatus為主,或者兩者比例相當(dāng),部分病人還存在少量的L.jensenii、L.gasseri。L.iners僅僅存活于血瓊脂培養(yǎng)基,而傳統(tǒng)培養(yǎng)乳酸桿菌采用Rogosa或MRS等選擇培養(yǎng)基,難以對(duì)其進(jìn)行分離和識(shí)別。近年來應(yīng)用分子技術(shù)發(fā)現(xiàn)L.iners在陰道菌群中具有重要作用。Ling等檢測(cè)了我國(guó)浙江省健康女性陰道分泌物,證實(shí)L.crispatus為我國(guó)漢族女性最常見的陰道菌群亞型。而Ravel等分析了北美地區(qū)白裔、非裔、西班牙裔和亞裔的健康育齡期女性陰道分泌物,發(fā)現(xiàn)亞裔的陰道優(yōu)勢(shì)菌群為L(zhǎng).iners,而白裔為L(zhǎng).crispatus,提示陰道菌群的構(gòu)成存在種族差異和地域區(qū)別。Antonio等發(fā)現(xiàn)即使是同一地區(qū)、同一種族女性,作為陰道優(yōu)勢(shì)菌群的產(chǎn)H2O2乳桿菌亞群也可以非同一類型,產(chǎn)H2O2能力和pH環(huán)境亦有所區(qū)別,個(gè)體之間存在顯著差異性,彭國(guó)麗等還發(fā)現(xiàn)陰道中的L.crispatus數(shù)量在不同季節(jié)存在明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)除了乳酸桿菌,部分正常女性陰道分泌物內(nèi)可見少量Gardnerella、Granulicatella、Streptococcus、Prevotella、Escherichia和其它菌屬。本研究發(fā)現(xiàn)按Amsel標(biāo)準(zhǔn)及Nugent評(píng)分確診的37例BV患者中,30例患者乳酸桿菌明顯減少,其相對(duì)比例從45%到1%(24例),以L.iners為主,部分患者(6例)甚至未檢出,與文獻(xiàn)報(bào)道不同的是有7例患者以L.gasseri、L.acidophilus為優(yōu)勢(shì)菌群的,但所占比例較少,部分患者還存在少量的L.jensenii、L.crispatus、L.gasseri、L.acidophilus,在陰道陰道微生態(tài)體系所起作用仍未明確,這可能與BV產(chǎn)生耐藥,引起復(fù)發(fā)或者與BV的自身修復(fù)作用有關(guān),需要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行研究。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)L.iners是唯一能從BV患者陰道分泌物中檢測(cè)到的產(chǎn)H2O2乳桿菌亞群,而對(duì)于女同性戀人群的BV研究證實(shí)了L.gasseri可以促進(jìn)BV發(fā)生。Hernandez-Rodrigue等對(duì)墨西哥健康孕婦陰道分泌物檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其陰道菌群中L.acidophius占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(78%)。本研究發(fā)現(xiàn)BV患者陰道菌群中除了乳酸桿菌發(fā)生明顯變化外,陰道菌群Alpha多樣性、beta多樣性增加,Gardnerella、Granulicatella、Prevotella、Sneathia、Parvimonas、Dialister、Escherichia、Peptostreptococcus、Anaerococcus、Peptoniphilus、Mobiluncus、Klebsiella等增加。Gardnerella是構(gòu)成女性正常陰道菌群之一,但在BV時(shí)其含量顯著增高,其可以利用不替調(diào)節(jié)分子CD59激活P38-撕裂元-蛋白激酶通路,釋放細(xì)胞溶解素(Vaginolysin,VLY),致使上皮細(xì)胞死亡,VLY是膽固醇依賴溶細(xì)胞素(Cholesterol-dependentcytolysin,CDC)家族成員之一,能夠識(shí)別人類細(xì)胞表面補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子CD59,VLY-CD59的交互作用在BV及其并發(fā)癥的發(fā)生具有關(guān)鍵作用。Gardnerella可能通過形成生物膜來耐受抗生素的攻擊和抵抗宿主的免疫應(yīng)答,并且其可產(chǎn)生唾液酸酶和脯氨酸氨肽酶來降解陰道粘膜的保護(hù)因子如黏蛋白,使陰道分泌物呈均質(zhì)樣,促進(jìn)鱗狀上皮剝脫和厭氧菌在陰道表面的粘附。Gardnerella等厭氧菌的大量增殖,致使陰道產(chǎn)H2O2乳酸桿菌生長(zhǎng)受到抑制,H2O2和乳酸的產(chǎn)生大大減少,同時(shí)其可分解氨基酸產(chǎn)生大量的胺,使得陰道pH值升高(pH>4.5)。Marrazzo等發(fā)現(xiàn)持續(xù)性BV與梭菌門的BVAB1、BVAB2、BVAB3和Peptoniphiluslacri