益生菌對肉雞免疫功能和腸黏膜抗氧化能力的影響

益生菌對肉雞免疫功能和腸黏膜抗氧化能力的影響

隨著生活水平的提高，山羊產(chǎn)品的質(zhì)量受到了密切關(guān)注，飼料引起的動物安全越來越受到重視。為了提高畜產(chǎn)品質(zhì)量,人們越來越傾向于無污染、無殘留的飼料添加劑。作為替代抗生素的一種新型綠色添加劑,益生菌能提高家禽生產(chǎn)性能,使飼料利用率提高3.9%~32.2%,尤其養(yǎng)殖環(huán)境不太理想的情況下效果更佳;同時(shí),益生菌可調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)平衡,提高免疫力,增強(qiáng)機(jī)體對內(nèi)、外環(huán)境不良刺激的抵抗能力。但畜禽養(yǎng)殖中,益生菌的促生長、促免疫作用受諸多因素影響,應(yīng)用效果差異較大。因此,全面認(rèn)識微生態(tài)系統(tǒng)對營養(yǎng)代謝和免疫功能的調(diào)控作用就顯得十分重要。目前,有關(guān)益生菌的試驗(yàn)研究大多集中于常規(guī)日糧,而在低營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌對動物抗氧化功能、黏膜免疫影響的研究則鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)通過在不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌,研究其對肉雞免疫器官指數(shù)、抗氧化功能、腸黏膜免疫及腸道菌群的影響,評估益生菌在宿主內(nèi)的免疫效應(yīng)并探究其機(jī)理,為研發(fā)抗生素替代品和節(jié)約飼料資源提供理論根據(jù)。1材料和方法1.1產(chǎn)品活菌計(jì)數(shù)益生菌由北京九州互聯(lián)農(nóng)牧有限公司提供,以枯草芽孢桿菌為主要菌種,并包含地衣芽孢桿菌和乳酸桿菌等,產(chǎn)品活菌總數(shù)大于1.0×1010CFU/g。1.2試驗(yàn)前期和試驗(yàn)后期1日齡AA肉雞由安徽和威集團(tuán)提供,試驗(yàn)為期42d,其中1~21d為試驗(yàn)前期,22~42d為試驗(yàn)后期。試驗(yàn)日糧參照NRC(1994)《家禽的營養(yǎng)需要量》配制(表1)。1.3基礎(chǔ)日糧和日糧活菌試驗(yàn)采用2×2雙因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),選用1日齡肉雞320只,隨機(jī)分成4組,每組10個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)8只雞,分別飼喂以下4種日糧:正對照組(NC):基礎(chǔ)日糧;負(fù)對照組(LC):低能低蛋白日糧,使基礎(chǔ)日糧前后期的代謝能均降低320kJ/kg,粗蛋白均降低0.85%;試驗(yàn)1組(NP):基礎(chǔ)日糧+0.01%益生菌,其日糧活菌總數(shù)大于1.0×106CFU/g;試驗(yàn)2組(LP):低能低蛋白日糧+0.01%益生菌,其日糧活菌總數(shù)大于1.0×106CFU/g。試驗(yàn)雞于室內(nèi)同一環(huán)境下采用層疊籠飼養(yǎng),每籠為一重復(fù),24h光照,每天喂料2次,自由采食和飲水,以重復(fù)為單位每天記錄飼料飼喂量和剩余量,每天清洗飲水器和料槽1次。免疫接種及疾病預(yù)防、消毒按常規(guī)方法進(jìn)行。1.4血清指標(biāo)檢測在試驗(yàn)的第21天和第42天,每組隨機(jī)選取8只中等大小的公雞屠宰,放血致死后迅速剖開腹腔,取脾臟、胸腺、法氏囊并稱重,計(jì)算各器官指數(shù)。器官指數(shù)=器官重/雞活體重。采集血液置于離心管中,待血清析出后,在低溫離心機(jī)中以3000r/min離心15min,取上清液(血清)分裝,測定血清丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和總抗氧化能力(T-AOC)。取十二指腸和空腸前半段,用眼科剪縱向剖開,清除表層食糜后再用載玻片刮取黏膜,將部分黏膜用4℃生理鹽水10倍體積稀釋后勻漿,4℃離心20min(4000r/min),取上清液分裝,測定黏膜勻漿液的MDA、T-SOD和T-AOC。血液和腸黏膜MDA、T-SOD和T-AOC所用試劑盒由南京建成生物工程研究提供。黏膜免疫球蛋白G(IgG)用競爭性放射免疫分析技術(shù)測定(試劑盒由濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司所提供)。黏膜分泌性免疫球蛋白A(SIgA)采用競爭性放射免疫分析技術(shù)測定(試劑盒由原子高科股份有限公司所提供)。1.5菌落的設(shè)置與培養(yǎng)分別于試驗(yàn)的第21天和第42天時(shí),每組隨機(jī)選取4只中等大小的公雞屠宰,無菌條件下取回腸內(nèi)容物0.5g左右,用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋;采用平板菌落計(jì)數(shù)法,大腸桿菌使用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基37℃有氧培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù);乳酸桿菌使用MRS瓊脂培養(yǎng)基37℃有氧培養(yǎng)48h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),結(jié)果以每克腸道內(nèi)容物中細(xì)菌個(gè)數(shù)的對數(shù)lg(CFU/g)表示。1.6益生菌與日糧互作模型試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件GLM模型進(jìn)行兩因子方差分析,模型主效應(yīng)包括日糧的營養(yǎng)水平(N/L)、益生菌不添加或添加(C/P)以及二者的互作,用Duncan進(jìn)行多重比較,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(X±SE)表示。2結(jié)果2.1臟器指數(shù)和法氏囊指數(shù)的影響由表2可知,益生菌能極顯著提高21d肉雞的胸腺指數(shù)(P<0.01),顯著提高21d脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)(P<0.05),對42d的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)均沒有顯著影響(P>0.05);日糧營養(yǎng)水平及其與益生菌的互作對21d和42d的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)均沒有顯著影響(P>0.05)。2.2日糧營養(yǎng)水平對血清t-sod和t-aoc活性的影響由表3可知,益生菌能提高肉雞前期血清T-SOD的活性(P<0.05),降低肉雞前期血清MDA的含量(P<0.01),能提高后期血清T-SOD和T-AOC活性(P<0.01),降低后期MDA的含量(P<0.05);日糧營養(yǎng)水平對血清前、后期的T-SOD、MDA和T-AOC均無顯著影響(P>0.05);益生菌和日糧營養(yǎng)水平的互作對血清前期抗氧化功能無顯著影響(P>0.05),對后期T-SOD(P=0.094)和T-AOC(P=0.060)有提高趨勢,對后期MDA無顯著改變(P>0.05)。2.3益生菌、營養(yǎng)水平對21d和32d黏膜抗氧化性能的影響由表4可知,益生菌能顯著提高黏膜21d的T-SOD活性(P<0.05),對21d黏膜MDA含量也有一定降低趨勢(P=0.057),能顯著降低42d黏膜MDA含量(P<0.05),對T-SOD和T-AOC沒有顯著影響(P>0.05);日糧營養(yǎng)水平對21d、42d黏膜抗氧化性能沒有顯著影響(P>0.05);益生菌和營養(yǎng)水平的互作對黏膜抗氧化影響不大(P>0.05)。益生菌對飼喂不同營養(yǎng)水平日糧肉雞黏膜IgG和SIgA的影響見表5。益生菌可顯著提高21d黏膜IgG的含量(P<0.05),對21d黏膜SIgA含量沒有影響(P>0.05),顯著提高42d黏膜IgG和SIg含量(P<0.01或P<0.05);日糧營養(yǎng)水平對肉雞前后期的黏膜IgG和SIgA均沒有顯著影響(P>0.05)。2.4日糧營養(yǎng)水平對21d回腸乳酸桿菌數(shù)量的影響如表6所示,益生菌能降低21d、42d回腸大腸桿菌數(shù)量(P<0.05),提高21d回腸乳酸桿菌的數(shù)量(P<0.001),對42d回腸乳酸桿菌數(shù)量沒有顯著影響(P>0.05);日糧營養(yǎng)水平對21d回腸乳酸桿菌數(shù)量有顯著影響(P<0.05),對21d大腸桿菌沒有顯著影響(P>0.05),對42d大腸桿菌、乳酸桿菌數(shù)量均沒有影響(P>0.05);益生菌和日糧營養(yǎng)水平的互作對21d、42d回腸菌群均沒有顯著影響(P>0.05)。3討論3.1益生菌對肉仔雞免疫指標(biāo)的影響胸腺、法氏囊和脾臟作為肉雞最重要的免疫器官,其發(fā)育狀態(tài)和機(jī)能強(qiáng)弱直接影響家禽的免疫機(jī)能。益生菌能促進(jìn)胸腺、法氏囊等免疫器官的生長發(fā)育,提高動物對外界刺激和疾病的抵抗力。趙希彥研究表明,添加0.2%芽孢桿菌制劑使21d肉雞的脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)顯著提高。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在不同營養(yǎng)水平下添加益生菌,特別是低營養(yǎng)水平日糧中,肉雞前期胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均有所提高,對肉雞后期的免疫器官指數(shù)沒有影響,這表明添加益生菌后,可適當(dāng)降低日糧營養(yǎng)水平,在保證動物正常生長的同時(shí),可促進(jìn)肉雞前期的免疫器官發(fā)育,完善肉仔雞免疫系統(tǒng)。而肉雞后期自身的免疫功能已健全,應(yīng)對外界刺激的能力增強(qiáng),添加益生菌對對肉雞后期免疫器官指數(shù)無明顯效果。3.2清除自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)機(jī)體的抗氧化體系是由酶促和非酶促抗氧化體系共同維持的,酶促抗氧化體系主要包括谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶、超氧化物歧化酶以及過氧化氫酶等,它們可以有效清除O-、H2O2、ROOH等中的活性氧并終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。血液SOD活性、MDA含量以及T-AOC是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)研究表明,在低營養(yǎng)水平下添加益生菌,都能提高血液T-SOD的活性,降低血液MDA的含量,對T-AOC也有一定提高,這與段穎等、楊家軍等在蛋雞和小鼠中的研究報(bào)道一致,提示益生菌能增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,減少過氧化物對機(jī)體的損傷。3.3益生菌對腸道黏膜抗氧化能力的影響腸道黏膜處于溝通機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的重要位置,黏膜的完整性是維持腸道正常功能的重要保證,對保護(hù)腸道具有重要意義。MDA可與蛋白質(zhì)、核酸(DNA、RNA)和磷脂等含有氨基的物質(zhì)交聯(lián),引起黏膜或細(xì)胞損傷。黏膜中的SOD能夠消除超氧陰離子的毒性,保護(hù)黏膜和腸壁細(xì)胞免受損傷。有研究表明,益生菌能產(chǎn)生多種抗氧化酶,如超氧化物歧化酶、含錳過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等,可清除黏膜自由基,防止過氧化反應(yīng)損害腸道黏膜。本試驗(yàn)表明,在不同營養(yǎng)水平下添加益生菌能提高肉雞黏膜的T-SOD活性,降低黏膜的MDA含量,增強(qiáng)總抗氧化能力,減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。這提示益生菌能增加黏膜抗氧化能力的作用,保護(hù)腸道黏膜,維持腸道正常功能,從而促進(jìn)動物健康生長。腸道黏膜中IgG和SIgA可以加強(qiáng)腸道細(xì)胞吞噬作用,,是防御病菌在腸道黏膜黏附和定植的第一道防線。益生菌可在腸道黏附定植,發(fā)揮特異性免疫作用活化相關(guān)淋巴組織,使SIgA生物合成增加,提高黏膜免疫功能。Vinderola等用瑞士乳桿菌灌喂小白鼠發(fā)現(xiàn),小腸中SIgA漿細(xì)胞量有所增加,提示益生菌能增強(qiáng)黏膜免疫功能。本試驗(yàn)中,在不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌,能提高21d肉雞腸道黏膜中的IgG和42d黏膜SIgA水平,這表明益生菌能增強(qiáng)肉雞的黏膜免疫功能,其作用機(jī)理可能是:益生菌及其分泌物可作為抗原發(fā)揮免疫佐劑作用,活化腸黏膜內(nèi)的微皺褶細(xì)胞和派伊氏淋巴結(jié),與腸道上皮細(xì)胞及黏膜固有層免疫細(xì)胞相互作用,誘導(dǎo)腸道局部免疫反應(yīng),從而增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫能力,防止致病菌或毒素在體內(nèi)造成損害。3.4益生菌改善腸道微生物環(huán)境腸道消化系統(tǒng)對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收能力部分依賴于腸道中微生物分布的種類和數(shù)量。腸道中微生物的種類和數(shù)量決定了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝范圍和程度,它們與宿主的健康、疾病有著極其密切的聯(lián)系。當(dāng)腸道微生態(tài)系統(tǒng)受到環(huán)境變化、采食、應(yīng)激等因素的影響,其有益菌衍生的有益作用不能滿足動物的生長要求,導(dǎo)致腸道功能發(fā)生紊亂,引起疾病的發(fā)生。而添加益生菌能有效調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的種類,促進(jìn)腸道有益菌增殖,同時(shí)可與有害微生物進(jìn)行競爭,維持和調(diào)整腸道微生態(tài)平衡。孫瑞鋒等研究表明,添加枯草芽孢桿菌可降低21d大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量,增加乳酸桿菌數(shù)量,從而調(diào)節(jié)肉雞腸道微生態(tài)環(huán)境。本試驗(yàn)中,在不同營養(yǎng)水平日糧中添加益生菌能極顯著提高21d肉雞回腸的乳酸桿菌數(shù)量,降低21d、42d回腸大腸桿菌數(shù)量,但日糧營養(yǎng)水平則對腸道菌群影響不大,這提示益生菌在低營養(yǎng)水平日糧中也能發(fā)揮其抑制病原微生物、促進(jìn)有益菌增殖的作用,其可能機(jī)制是:益生菌與腸道有益菌協(xié)同,通過有氧發(fā)酵,維持腸道的厭氧環(huán)境,從而排