表觀遺傳調(diào)節(jié)在胚胎精發(fā)育中的作用

表觀遺傳調(diào)節(jié)在胚胎精發(fā)育中的作用

表觀遺傳是在20世紀(jì)80年代逐漸發(fā)展起來的一門學(xué)科。它是在許多生命現(xiàn)象的研究中貫徹經(jīng)典的遺傳規(guī)律和許多不規(guī)則行為的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。與經(jīng)典遺傳研究中以特定基因序列影響生物學(xué)功能為核心的遺傳遺傳研究相比，在沒有核心細(xì)胞序列變化的情況下，基因的功能是可逆轉(zhuǎn)的，遺傳因素的出現(xiàn)是非常重要的。這也是細(xì)胞分裂和分裂最活躍的時期，相應(yīng)的遺傳因素也非常復(fù)雜。表觀遺傳因素和遺傳因素共同控制了早期胚胎的形成。1指甲基化和胚胎發(fā)育1.1dnnt3基因轉(zhuǎn)移酶DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)的作用下,將S腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine,簡稱SAM)的甲基添加在DNA分子中的堿基上,最常見的是加在胞嘧啶第5位碳原子上,由此形成5甲基胞嘧啶(5-mC).富含CpG的序列稱為CpG島,其不均衡地分布于哺乳動物基因組.哺乳動物的Dnmt有3種:Dnmtl、Dnmt2、Dnmt3.Dnmt1主要作用是在DNA復(fù)制和修復(fù)中維持其甲基化.Dnmt2主要為tRNA的甲基轉(zhuǎn)移酶,具有微弱的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性.Dnmt3包括了兩個從頭甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a、Dnmt3b和一個調(diào)節(jié)蛋白Dnmt3L,主要作用是催化CpG從頭甲基化.在胚胎發(fā)育中,Dnmt1的甲基化作用發(fā)生在植入期,并維持其甲基化的作用;但Dnmt1在小鼠受精卵雄性前核和雌性前核中定位是不相同的,這說明Dnmt1與親本基因組DNA甲基化不對稱性有密切關(guān)系.Dnmt3a、Dnmt3b在ES細(xì)胞中表達豐度較成體組織高,在胚胎細(xì)胞分化過程中參與了CpG島的甲基化;而動態(tài)的DNA甲基化修飾通常發(fā)生在決定種系分化基因的非CpG島區(qū)域,這對大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中記憶的形成有重要作用.Dnmt3a、Dnmt3b失活會干擾ES細(xì)胞中DNA從頭甲基化,其基因突變的小鼠胚胎畸形和死亡率極高.另外,有研究顯示Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b可以聯(lián)合作用,調(diào)節(jié)E鈣粘素(E-cadherin)的表達,從而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜對胚胎的接受能力,異常的胚胎植入和流產(chǎn)都有可能與Dnmts的異常有關(guān).敲除Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b雙突變的小鼠胚胎干細(xì)胞在未分化狀態(tài)仍然能夠增殖,在體外卻不能分化.上述研究結(jié)果說明無論是DNA從頭甲基化還是DNA甲基化的維持都是胚胎發(fā)育的重要環(huán)節(jié).最新的研究表明,在敲出Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b3種酶的核移植的小鼠胚胎(TKO-NT)和野生型小鼠胚胎(WT)比較中發(fā)現(xiàn),TKO-ES細(xì)胞在分化外胚層細(xì)胞中逐漸死亡,但卻能分化為胚外胚層細(xì)胞.從TKO-NT囊胚中建立滋養(yǎng)層干細(xì)胞(ntTScells)能夠自我更新,并具備干細(xì)胞基本的基因表達形式.1.2小鼠主動去甲基化的影響DNA甲基化在生殖細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育階段經(jīng)歷了基因組范圍內(nèi)重編程.Southernblot實驗顯示,小鼠精子細(xì)胞染色質(zhì)重復(fù)序列的甲基化程度高于卵細(xì)胞中重復(fù)序列,兩者的基因啟動子同樣低甲基化,而且精子和卵子染色質(zhì)甲基化水平都高于早期胚胎.哺乳動物受精卵在受精幾個小時后父源性基因經(jīng)歷了非復(fù)制依賴性、基因組范圍內(nèi)的去甲基化過程,而母源性基因甲基化水平一直維持到受精卵開始有絲分裂.之后,隨著每一次有絲分裂,父源性基因和母源性基因就經(jīng)歷一次復(fù)制依賴性、被動去甲基化(由于核因子NF粘附甲基化的DNA,使粘附點附近的DNA不能被完全甲基化,從而阻斷Dnmt1的作用而被動甲基化)的過程.這樣,配子的基因組DNA甲基化很大程度上被擦除,但這并沒有導(dǎo)致印記位點的丟失.小鼠PN2(原核期胚胎2期)期雄性前核DNA就開始去甲基化,到PN4期甲基化信號已經(jīng)檢測不到了.這種去甲基化的過程同樣發(fā)生在大鼠、豬和人的早期胚胎中,但牛的雄性前核去甲基化的程度要低于以上幾種哺乳動物;而兔的早期胚胎父源性染色質(zhì)去甲基化發(fā)生在前核前期.這種甲基化修飾模式的改變可能對于早期胚胎轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有重要作用,或者有助于減少表觀遺傳修飾的跨代積累.主動去甲基化是由去甲基酶將甲基集團移去的過程.主動去甲基化的機制現(xiàn)在還不確定.有關(guān)研究表明,小鼠受精卵發(fā)生主動去甲基化的父源性基因中MBD4(甲基化的CpG島結(jié)合域蛋白4)是缺失的;在沒有S-腺苷甲硫氨酸的條件下,從頭甲基化酶Dnmt3a、Dnmt3b能將胞嘧啶上5甲基轉(zhuǎn)移到胸腺嘧啶上,這些都可能促進主動去甲基化作用.在經(jīng)歷了基因組的去甲基化之后,哺乳動物的早期胚胎又經(jīng)歷了一次從頭甲基化的過程,其中牛從頭甲基化發(fā)生在早期胚胎8-16細(xì)胞時期,小鼠發(fā)生在囊胚內(nèi)細(xì)胞團時期.有研究表明,在人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干、祖細(xì)胞分化時大約1.4%的CpG島發(fā)生了顯著的重新甲基化的過程.2致突變作用的基因表達真核生物染色體中主要包括5種組蛋白,即核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4和連接組蛋白H.生殖細(xì)胞特異性連接組蛋白H1FOO,通過與染色質(zhì)的結(jié)合,改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu),進而參與卵母細(xì)胞的成熟,也可重塑受精卵中精子染色質(zhì).干擾H1FOOmRNA能阻礙小鼠GV期卵母細(xì)胞體外成熟;而把體外合成H1FOOmRNA注射停滯在MI期卵母細(xì)胞,可恢復(fù)H1FOO表達并提高體外成熟率,這說明H1FOO在卵母細(xì)胞成熟過程中是必需的.染色體組蛋白尾部氨基酸殘基可受多種共價修飾,包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化及ADP核糖基化,其與染色體模板上的組蛋白替換共同決定核小體的狀態(tài),進而決定細(xì)胞的狀態(tài).對ES細(xì)胞和多種不同的分化細(xì)胞進行分析,顯示幾乎所有活性基因啟動子都和多組蛋白修飾(如:H3K4me和H3K4Ac)相關(guān)聯(lián);而失活的基因和其啟動子與H3K36me3或者H3K9me3相關(guān)聯(lián).2.1小鼠體外受精神培養(yǎng)中乙?；揎椀谋匾越M蛋白乙?；?histoneacetyhransferases,HATs)和組蛋白去乙?；?histonedeacetylases,HDACs)是一對重要的調(diào)控酶,均修飾組蛋白氨基端的殘基,分別引起染色體組蛋白乙?；腿ヒ阴；?并且該過程是可逆的.目前,HATs分為6類,主要功能是對核心組蛋白氨基端的賴氨酸殘基進行乙?；揎?從而使染色質(zhì)疏松,提高基因轉(zhuǎn)錄活性.敲除HATs不同家族成員的小鼠胚胎發(fā)育嚴(yán)重受阻,主要表現(xiàn)為胚胎缺少特異性脊索中胚層和軸旁中胚層分化來的結(jié)構(gòu),死胎,嚴(yán)重的顱神經(jīng)管閉合缺陷和露腦畸形,影響神經(jīng)胚形成、細(xì)胞增殖,導(dǎo)致心臟發(fā)育缺陷.目前已經(jīng)報道哺乳動物體內(nèi)的HDACs有18種,一般認(rèn)為組蛋白去乙?；饔门c基因轉(zhuǎn)錄的抑制有關(guān),在小鼠胚胎發(fā)育后期HDAC1,HDAC2和HDAC3均有較強表達,在植入前早期胚胎HDAC1表達更強,而且HDACs時序性規(guī)律表達對小鼠腸發(fā)育至關(guān)重要,并參與胚胎心臟和骨骼肌的發(fā)生.免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示,小鼠卵母細(xì)胞中H3K9、H3K18、H4K5和H4K12的乙?；B同H3K4和H3K9的甲基化信號強度隨著卵母生長而增加,生長完全的生殖泡期卵母細(xì)胞修飾程度最高.而且在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中,所有賴氨酸乙?；浇抵翙z測不到或可忽略的水平.H4K12在卵母細(xì)胞進入第1次減數(shù)分裂期后去乙酰化,在完成時又瞬時乙?；?第2次減數(shù)分裂時再次去乙?；?這種修飾模式變化在豬的卵細(xì)胞中也已經(jīng)證實,且有實驗表明H4K12Ac水平顯著提高會導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育潛能受限.在體外培養(yǎng)的小鼠卵母細(xì)胞有絲分裂II期(MII)和2-細(xì)胞時期的胚胎中,組蛋白H3上組蛋白乙?；窯CN5(generalcontrolnucleotidesynthesis,GCN5)和HDAC1表達是下調(diào)的,但是在體外培養(yǎng)成熟的卵細(xì)胞和胚胎中H3的乙酰化程度沒有變化.乙?；c去乙酰化這種動態(tài)變化有細(xì)胞周期依賴性,受到細(xì)胞代謝狀態(tài)和細(xì)胞外信號的調(diào)節(jié).小鼠受精卵中H4K8、H4K12乙?；揎椩诰蛹?xì)胞核去凝縮前已被檢測到,而且在前核形成前乙酰化和磷酸化的其他組蛋白在父源性染色質(zhì)上也都是富集的,前核形成之后這些組蛋白修飾在異染色質(zhì)上就缺失了,這種組蛋白修飾模式的改變可能與染色質(zhì)和異染色質(zhì)的重塑相關(guān)聯(lián).在ES細(xì)胞中,常染色質(zhì)乙?；礁?而與之相反,譜系不同的分化細(xì)胞,乙?；骄哂胁町?但都表現(xiàn)出形成無轉(zhuǎn)錄活性的異染色質(zhì)、乙?；浇档?、甲基化水平升高等特點.這些表明高水平的乙?；揎椗c染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄激活相關(guān),低水平的乙?；揎椗c染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān).2.2小鼠體生殖細(xì)胞的變化組蛋白甲基化在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因組完整性及表觀遺傳繼承方面起著重要作用.組蛋白甲基化通常發(fā)生在組蛋白尾部未乙酰化的賴氨酸或精氨酸殘基上,包括單甲基化、雙甲基化和三甲基化.H3、H4甲基化依賴所修飾的賴氨酸殘基的不同而激活或抑制轉(zhuǎn)錄,如H3K4、H3K36及H3K79甲基化主要與染色質(zhì)活化區(qū)域有關(guān),而H3K9、H3K27及H4K29甲基化主要位于染色質(zhì)沉默區(qū)域.甲基化轉(zhuǎn)移酶EHMT2(常染色質(zhì)組蛋白賴氨酸N甲基轉(zhuǎn)移酶2)在小鼠未分化ES細(xì)胞中使126個基因的常染色質(zhì)轉(zhuǎn)變成異染色質(zhì)而沉默,而這些基因的啟動子區(qū)域染色質(zhì)都存在H3K9me3修飾.在小鼠胚胎8.5d(E8.5),H3K9me2、H3K27me3是PGCs(原始生殖細(xì)胞)獲得多潛能性所必需的;除此之外,H3K4me2、H3K4me3、H3K9Ac(轉(zhuǎn)錄激活的特征性修飾)和H4/H2AR3me2轉(zhuǎn)錄抑制標(biāo)志)在PGCs也是高水平表達的,這些變化都是生殖細(xì)胞所特有的,與多潛能性特征性轉(zhuǎn)錄因子共同促進來源于PGCs的胚胎生殖細(xì)胞形成;在胚胎E11.5至E13.5,DNA甲基化印記被擦除,H3K9me3、H3K27me3、H4/H2AR3me2s等修飾形式缺失或表達下調(diào).與小鼠受精卵不同,豬的雄性前核有明顯的H3K9me3修飾,這可能與保護父源性胞嘧啶甲基化修飾模式有關(guān).在哺乳動物中,組蛋白精氨酸甲基化主要位于H3R2、H3R8、H3R17、H3R26和H4R3上.組蛋白H3Rs甲基化促進早期受精卵卵裂,內(nèi)細(xì)胞團多潛能細(xì)胞的形成,而在滋養(yǎng)外胚層H3精氨酸是低甲基化的.2.3macroha在表觀遺傳修飾中的作用早期胚胎發(fā)育過程中的表觀遺傳非對稱性不僅與組蛋白修飾模式改變有關(guān),而且與組蛋白之間的替換有關(guān).在小鼠8細(xì)胞和16細(xì)胞胚胎中H1FOO蛋白開始在細(xì)胞質(zhì)中消失,在桑葚胚及囊胚期完全消失,被體細(xì)胞Hl替換.組蛋白macroH2A是組蛋白H2A的變體,在哺乳動物中是保守的,是減數(shù)分裂中異染色質(zhì)著絲粒的組成成分,在表觀遺傳修飾(包括X染色體失活)中起作用.對小鼠研究發(fā)現(xiàn),macroH2A在生長晚期及完全生長期卵母細(xì)胞生殖泡中出現(xiàn),不僅與成熟卵母細(xì)胞染色體相關(guān),還出現(xiàn)在極體中,而在雙原核合子中消失.把人的精子注射到小鼠的卵細(xì)胞,用高度特異H3變異體H3.1/H3.2抗體標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)在受精卵S前期去凝縮的人精子染色質(zhì)中有明顯的H3.1/H3.2,這些核染色質(zhì)可能在之后的胚胎發(fā)育中作為表觀遺傳修飾的復(fù)制模板.H3.3是卵母細(xì)胞中存在的因子,并在合子基因組轉(zhuǎn)錄激活前特異性分布在雄性原核中.由此推測,H3.3與雄性原核基因轉(zhuǎn)錄激活有關(guān),并且H3.3分布變化與胚胎基因轉(zhuǎn)錄的3個轉(zhuǎn)錄點(2-細(xì)胞期,4-細(xì)胞期,囊胚期)同步,H3.3可能通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)基因表達.而最新實驗表明,用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)技術(shù)在小鼠的ES細(xì)胞和植入前胚胎中檢測到12種組蛋白變異體和兩種組蛋白重組酶,而且未分化ES細(xì)胞中H2AZ表達量最高.隨著胚胎的發(fā)育H2AZ和H3變異體也表達上調(diào).3h3k9基因的甲基化和組蛋白修飾在基因表達調(diào)節(jié)中的協(xié)同作用基因的正常轉(zhuǎn)錄首先需要有合適的染色質(zhì)結(jié)構(gòu),組蛋白修飾參與調(diào)控這一環(huán)節(jié),組蛋白與DNA結(jié)合的改變,使染色質(zhì)獲得合適的轉(zhuǎn)錄狀態(tài).這一環(huán)節(jié)在不同基因的激活過程中由于基因所在染色質(zhì)區(qū)域本身的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的不同而表現(xiàn)不同,這表明基因的甲基化修飾和組蛋白修飾在基因的調(diào)節(jié)中,既可單獨發(fā)揮作用,也可能協(xié)同作用.羊和小鼠受精卵DNA甲基化雖然不同,但H3K9修飾是相似的,相對于雌性前核,雄性前核都是低甲基化或者是高乙?；?進一步實驗表明,父源性DNA甲基化水平與H3K9的乙?；瘺]有太大的關(guān)聯(lián).H3K9甲基化抑制雌性前核的基因組DNA主動去甲基化,H3K9甲基化缺失促進了雄性前核DNA主動去甲基化.體外單精子顯微注射受精的小鼠受精卵雄性前核甲基化位點富集H3K9m3.這種組蛋白修飾模式在牛和豬的雄性前核中也存在.在牛的雄性前核中,DNA主動去甲基化和從頭甲基化的過程伴隨著H3K9三甲基化的修飾的發(fā)生.4dna甲基化和組蛋白修飾在早期胚胎發(fā)育中的作用動物早期胚胎發(fā)育過程中的表觀遺傳調(diào)節(jié)機制是當(dāng)前表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一.研究早期胚胎的表觀遺傳修飾對了解胚胎發(fā)育機制、揭示胚胎發(fā)育失敗的原因有重要意義.胚胎早期發(fā)育中的變化過程為研究表觀遺傳修飾對基因表達的影響,以及與早期胚胎發(fā)育全能性之間相互關(guān)系提供了很好的時間窗口.近年來DNA甲基化和組蛋白修飾在早期胚胎發(fā)育中的作