宮頸鱗狀上皮病變發(fā)生發(fā)展過程中em與轉(zhuǎn)錄因子表達的相關(guān)性研究

宮頸鱗狀上皮病變發(fā)生發(fā)展過程中em與轉(zhuǎn)錄因子表達的相關(guān)性研究

宮頸是婦科最常見的腫瘤之一。隨著近年外科技術(shù)的成熟與相關(guān)抗宮頸癌藥物的臨床應(yīng)用,宮頸癌的綜合治療療效顯著提高。然而,由于迄今對宮頸癌惡性行為尚缺乏有效監(jiān)控及治療措施,仍有許多宮頸癌患者死于癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此,早期發(fā)現(xiàn)和治療仍是降低宮頸癌發(fā)病率及死亡率的重要手段之一。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是腫瘤形成及侵襲轉(zhuǎn)移非常重要的過程,與惡性腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。轉(zhuǎn)錄因子Twist及Snail被認為在多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展中,具有下調(diào)上皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)、上調(diào)彈性蛋白(vimentin)表達、誘導(dǎo)EMT及促進腫瘤形成與發(fā)展的作用。本研究通過探討對慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintra-epithelialneoplasia,CIN)及宮頸鱗癌中轉(zhuǎn)錄因子E-cadherin,Vimentin及Twist,Snail表達的檢測及相關(guān)性分析,旨在為宮頸鱗狀上皮腫瘤發(fā)生過程中,可能存在的生物學(xué)機制研究及宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療和預(yù)后監(jiān)測等,提供科學(xué)有效的理論基礎(chǔ)和依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果,報道如下。1對象和方法1.1納入及被模型學(xué)檢測的患者年齡分布選擇荊州市婦幼保健院2005年1月至2009年12月宮頸組織活檢及手術(shù)切除中,確診為宮頸鱗狀上皮病變的170例存檔石蠟塊標本為研究對象(均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋、HE染色,切片厚度為4μm,組織病理學(xué)結(jié)果經(jīng)2位病理科醫(yī)師診斷并復(fù)核)。其中,慢性宮頸炎標本為20例,納入慢性宮頸炎標本組;CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ及宮頸鱗癌標本各為32例,27例,35例及56例,分別納入CINⅠ組,CINⅡ組,CINⅢ組及宮頸鱗癌組。慢性宮頸炎組及CINⅠ～Ⅲ組患者年齡為27～70歲,中位年齡為42.5歲。宮頸癌組患者年齡為32～65歲,中位年齡為48歲;高分化為28例,中分化為23例,低分化為5例;按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(InternationalFederationofGynecologyandObstetrics,FIGO)對宮頸癌的臨床分期(2000)為Ⅰ～ⅡA期。本組170例患者術(shù)前均未接受其他特殊治療(包括放、化療)(本研究遵循的程序符合荊州市婦幼保健院人體試驗委員會所制定的倫理學(xué)標準,得到該委員會批準,并與患者簽署臨床研究知情同意書)。1.2轉(zhuǎn)錄因子表達及轉(zhuǎn)導(dǎo)法檢測陰道循環(huán)治療細胞培養(yǎng)采用原位雜交(insituhybridization,ISH)技術(shù)及細胞免疫組化SABC法,檢測170例宮頸鱗狀上皮病變組織標本中轉(zhuǎn)錄因子Twist,Snail及E-cadherin與Vimentin表達。1.2.1免疫組化試劑E-cadherin兔多克隆抗體,Vimentin小鼠單克隆抗體,即用型SABC免疫組化試劑盒,Twist,Snail的ISH試劑盒等,均購自武漢博士德生物工程有限公司。1.2.2免疫組化染色按照抗體說明書進行抗原修復(fù),SABC法進行免疫組化染色。2種一抗的工作濃度均為1∶100,并均以0.1mmol/LPBS代替一抗作為陰性對照。1.2.3t,snail寡核苷酸探針t,snael寡核苷酸探針I(yè)SH探針為地高辛標記的Twist,Snail寡核苷酸探針,操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。ISH采用PBS代替雜交液作為陰性對照。1.2.4n表達強度及判定標準以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為Twist,Snail及E-cadherin與Vimentin呈陽性表達。表達強度判定標準:每張切片隨機選取5個高倍視野,計數(shù)陽性細胞數(shù)并計算百分率。E-cadherin,Vimentin表達結(jié)果判定:若陽性細胞<10%為(-),≥10%則為(+)。Twist,Snail表達結(jié)果判定:陽性細胞<5%為(-),≥5%則為(+)。1.3統(tǒng)計分析方法本研究數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件包進行統(tǒng)計分析。多組數(shù)據(jù)陽性率(%)比較,采用秩和檢驗,相關(guān)性研究采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1不同時間點.e-cadhenin在慢性宮頸炎中的表達情況E-cadherin陽性信號定位于細胞膜。在慢性宮頸炎組中,E-cadherin于正常宮頸組織上皮細胞膜著色,細胞相鄰處呈連續(xù)線性、極性分布,并主要集中于基底層及大部分棘層細胞,呈較強的細胞膜表達;在宮頸鱗癌組中,癌細胞膜著色淺淡,呈點狀、小灶性分布,部分癌組織甚至完全不著色。E-cadherin在慢性宮頸炎組、CINⅠ～Ⅲ組及宮頸鱗癌組中的陽性表達率分別為80.0%(16/20),68.8%(22/32),55.6%(15/27),51.4%(18/35)及39.3%(22/56),在慢性宮頸炎→CINⅠ～Ⅲ→宮頸鱗癌的發(fā)展中,E-cadherin陽性表達率呈遞減趨勢,而且宮頸鱗癌組、CINⅢ組、CINⅡ組與慢性宮頸炎組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Vimentin陽性信號定位于細胞質(zhì)。Vimentin在慢性宮頸炎組中,正常宮頸組織鱗狀上皮層表達呈陰性或僅見單個細胞表達,而在CINⅢ組及宮頸鱗癌組中,細胞質(zhì)Vimentin表達增強。Vimentin在慢性宮頸炎、CINⅠ～Ⅲ組及宮頸鱗癌組中的陽性表達率分別為0(0/20),6.3%(2/32),7.4%(2/27),31.4%(11/35)及32.1%(18/56),而且宮頸鱗癌組及CINⅢ組中的Vimentin的陽性表達率與慢性宮頸炎組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.2snair陽性表達率Twist及Snail陽性信號定位于細胞質(zhì),部分定位于細胞核(圖1、圖2)。在慢性宮頸炎組、CINⅠ～Ⅲ組及宮頸鱗癌組,Twist陽性表達率分別為10.0%(2/20),28.1%(9/32),29.6%(8/27),42.9%(15/35)及64.3%(36/56);Snail陽性表達率分別為0(0/20),9.4%(3/32),22.2%(6/27),37.1%(13/35)及58.9%(33/56)。隨著宮頸病變加重,Twist及Snail的陽性表達率逐漸增強,而且Twist及Snail在宮頸鱗癌組中的表達最強,與慢性宮頸炎組及CINⅠ～Ⅲ組的陽性表達率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Twist在CINⅢ組的陽性表達率及Snail在CINⅡ組與Ⅲ組的陽性表達率,均顯著高于慢性宮頸炎組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.3snair表達陽性標本中e-cadhenin表達的相關(guān)性CINⅠ～Ⅲ組及宮頸鱗癌組68例Twist呈陽性標本中,47例E-cadherin表達呈陰性,Twist與E-cadherin表達呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.373,P<0.05);55例Snail表達呈陽性標本中,34例E-cadherin表達呈陰性,Snail與E-cadherin表達也呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.200,P<0.05),而E-cadherin與Vimentin之間的相關(guān)性不明顯(r=-0.125,P>0.05)。在CINⅢ組及宮頸鱗癌組標本中,Twist與Vimentin的陽性表達呈明顯正相關(guān)(r=0.226,P<0.05),而Snail與Vimentin相關(guān)性不明顯(r=0.098,P>0.05)。3snail與cin表達的相關(guān)性腫瘤細胞獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力,是腫瘤由良性發(fā)展成為惡性的重要階段。EMT是指上皮細胞在特定生理和病理情況下,向間充質(zhì)細胞分化的現(xiàn)象,即在EMT發(fā)生過程中,表現(xiàn)為上皮細胞失去極性,黏附能力下降,遷移和運動能力增加,同時細胞表型發(fā)生改變。其中,最為常見的就是上皮標志物E-cadherin基因蛋白下調(diào),間葉表型標記物Vimentin表達上調(diào)及誘導(dǎo)EMT的一些轉(zhuǎn)錄因子,如Twist與Snail等亦表達上調(diào)。E-cadherin是一種鈣依賴性細胞黏附分子,普遍存在于各類上皮細胞中,在維持正常上皮細胞形態(tài)、細胞極性及組織結(jié)構(gòu)完整性中起重要作用。對身體多數(shù)部位發(fā)生的惡性上皮性腫瘤的研究表明,E-cadherin表達下調(diào)和功能喪失與腫瘤去分化、浸潤性生長及轉(zhuǎn)移等預(yù)后不良明顯相關(guān)。Vimentin是細胞骨架蛋白之一,特異性分布于間質(zhì)細胞中。若其在上皮源性腫瘤組織中過表達,則可能與細胞生長分化狀態(tài)改變及細胞游走遷移有關(guān),是EMT的表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示,隨著宮頸病變的進展,E-cadherin陽性表達率呈遞減趨勢,特別是在高級別CIN及宮頸鱗癌組織中的陽性率明顯低于正常結(jié)構(gòu)的宮頸組織,而且宮頸鱗癌組、CINⅢ組、CINⅡ組與慢性宮頸炎組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而E-cadherin與Vimentin之間相關(guān)性不明顯(r=-0.125,P>0.05)。宮頸癌組和CINⅢ組的Vimentin表達明顯增強,而且宮頸鱗癌組及CINⅢ組中的Vimentin的陽性表達率與慢性宮頸炎組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此,在宮頸鱗狀上皮性病變發(fā)展過程中,E-cadherin表達下調(diào),Vimentin表達增強,細胞間黏附力減弱,腫瘤細胞彼此離散,向間質(zhì)及周圍移動,可能是良性宮頸鱗狀上皮病變進一步癌變的促進因素。Snail屬于鋅指蛋白家族成員,是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要調(diào)節(jié)因子,本質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子,可通過結(jié)合E-cadherin啟動子的E-box連接基序,而直接抑制E-cadherin表達,進而誘導(dǎo)EMT,促使腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展。免疫組化檢測人類多數(shù)腫瘤標本中Snail蛋白發(fā)現(xiàn),Snail異常表達于卵巢癌、甲狀腺癌及惡性黑色素瘤等。體外實驗構(gòu)建正義全長Snail真核表達載體轉(zhuǎn)染入宮頸癌細胞系Hela及SiHa,可明顯抑制E-cadherin表達,而Vimentin與Snail表達明顯上調(diào)。張儒英等采用免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),Snail高表達于宮頸癌組織,其陽性率明顯高于CIN組織,并且隨著CIN級別升高,Snail表達越明顯。這與本研究通過基因定位的結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示,宮頸鱗癌中Snail陽性率顯著高于宮頸鱗狀上皮良性病變,并與E-caherin表達下調(diào)相關(guān),但Snail與Vimentin的相關(guān)性并不明顯(r=0.098,P>0.05),這可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展階段、分化程度及其他不確定因素等有關(guān),認識二者在促進腫瘤形成中相互作用時,應(yīng)結(jié)合其他臨床指標綜合考慮。本研究結(jié)果顯示,Snail與E-cadherin表達也呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.200,P<0.05)。轉(zhuǎn)錄因子Twist是堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族成員之一,廣泛表達于中胚層起源組織細胞,參與中胚層發(fā)育及形態(tài)形成。隨著對EMT生物學(xué)機制認識的不斷深入,發(fā)現(xiàn)Twist也可通過抑制E-cadherin表達調(diào)節(jié)腫瘤細胞EMT。本研究結(jié)果顯示,Twist在宮頸癌中高表達,同時伴隨E-cadherin表達下調(diào)及Vimentin表達上調(diào),Twist與E-cadherin表達呈負相關(guān)關(guān)系(r=-0.373,P<0.05),而與Vimentin的陽性表