有關(guān)物質(zhì)定性研究的幾點(diǎn)思考

有關(guān)物質(zhì)定性研究的幾點(diǎn)思考

物質(zhì)研究一直是對(duì)藥店和藥理學(xué)的研究和技術(shù)評(píng)估的重點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著對(duì)有關(guān)物質(zhì)認(rèn)識(shí)的不斷深入,對(duì)有關(guān)物質(zhì)的技術(shù)要求也在不斷提高,其中對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行定性(鑒定)研究已經(jīng)成為有關(guān)物質(zhì)研究技術(shù)要求的重要組成部分,受到廣泛關(guān)注。但目前國(guó)內(nèi)有關(guān)物質(zhì)的定性研究仍是薄弱環(huán)節(jié),研究水平與國(guó)外先進(jìn)國(guó)家相比有較大的差距,這限制了我國(guó)藥品研究的水平和藥品質(zhì)量的提高,需要引起研發(fā)者的充分重視。1分析方法的應(yīng)用在新藥研究過(guò)程中,對(duì)藥物中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行定性研究具有重要意義。通過(guò)對(duì)有關(guān)物質(zhì)的定性研究,我們可以獲得有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息,分析了解其形成過(guò)程,合成時(shí)可設(shè)法避免該雜質(zhì)的形成,或經(jīng)純化使之降至可接受的水平。另外,還可以通過(guò)檢索毒性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)獲知該雜質(zhì)的毒性數(shù)據(jù),為其限度的確定提供有力的依據(jù)。同時(shí),定性研究也是分析方法確定的重要參考,對(duì)貯藏條件的確定也有指導(dǎo)意義。如果不了解有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu),后續(xù)的研究將無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行。對(duì)藥物中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行定性分析也是我國(guó)新藥研究與國(guó)際接軌的需要。按照ICHQ3A/Q3B指導(dǎo)原則以及2005年SFDA《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求,對(duì)藥物中超過(guò)鑒定限度的有關(guān)物質(zhì)皆應(yīng)明確其來(lái)源,并推測(cè)可能的結(jié)構(gòu)。但目前我國(guó)的藥物研發(fā)尚未能做到這一點(diǎn),要想與國(guó)際接軌,就必須在有關(guān)物質(zhì)研究的完整性和規(guī)范性上符合相關(guān)的要求。2采用多種方法進(jìn)行判斷按照研究方法的不同,有關(guān)物質(zhì)的定性研究可以分為理論推導(dǎo)法、直接測(cè)定法和間接測(cè)定法等,在實(shí)際的應(yīng)用中,這幾種方法常常結(jié)合使用,相互印證。一般而言,由于有關(guān)物質(zhì)的定性研究不能像原料藥的結(jié)構(gòu)確證一樣提供全面的信息,因而需要盡可能采用多種方法(直接測(cè)定法例外),提供盡可能多的信息和證據(jù),否則,有可能得到錯(cuò)誤的結(jié)論。下面對(duì)幾種方法分別進(jìn)行說(shuō)明。2.1雜質(zhì)譜分析法理論推導(dǎo)法是通過(guò)分析化合物的結(jié)構(gòu)及其合成路線,推測(cè)可能產(chǎn)生的雜質(zhì),是獲得有關(guān)物質(zhì)定性分析極為重要的手段,也可以給其他方法提供重要的指導(dǎo)。通過(guò)理論推導(dǎo),我們可以對(duì)藥物的雜質(zhì)譜類型有一個(gè)初步的了解,對(duì)于后續(xù)的測(cè)定非常重要,因此,理論推導(dǎo)法也可以稱為雜質(zhì)譜分析。需要強(qiáng)調(diào)的是,由于理論推導(dǎo)大多需要研究者有較深厚的合成背景,因而需要質(zhì)量分析人員與合成人員的密切配合,深入了解藥物的結(jié)構(gòu)特征和詳細(xì)的合成路線。另外,由于理論推導(dǎo)需要對(duì)合成路線中所有的雜質(zhì)進(jìn)行分析,因此需要了解每一步反應(yīng)。對(duì)于采用外購(gòu)中間體進(jìn)行一步或幾步反應(yīng)得到的產(chǎn)品,由于缺乏必要的信息,不適合采用理論推導(dǎo)法分析有關(guān)物質(zhì)的情況。理論推導(dǎo)法可以采用以下幾種方式。2.1.1合成所產(chǎn)生的雜質(zhì)起始原料對(duì)于藥物中的雜質(zhì)譜的種類具有決定作用,通過(guò)對(duì)起始原料中雜質(zhì)的分析,可以推測(cè)部分中間體及終產(chǎn)物中可能存在的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。例如:苯環(huán)衍生物的4-位鹵化物中?；煊?-位鹵化物,以其為起始原料則終產(chǎn)品中可能會(huì)生成1-位鹵代的副產(chǎn)物。如氟哌啶醇結(jié)構(gòu)為4-氟產(chǎn)物,通過(guò)對(duì)其起始原料的分析推測(cè)1-氟取代物是其可能的有關(guān)物質(zhì)之一。如圖1所示。2.1.2原料的確定化學(xué)反應(yīng)一般不可能實(shí)現(xiàn)100%的轉(zhuǎn)化,上一步反應(yīng)的原料就可能成為后續(xù)反應(yīng)乃至終產(chǎn)品中的雜質(zhì)。例如:鹽酸普魯卡因的合成,由于還原反應(yīng)的不徹底,硝基卡因混入后續(xù)步驟中,最后成為終產(chǎn)品中的一個(gè)主要雜質(zhì)。2.1.3副反應(yīng)及副反應(yīng)產(chǎn)物化學(xué)反應(yīng)往往存在副反應(yīng),因此分析可能的副反應(yīng)路線,就可以推測(cè)某些雜質(zhì)的形成途徑。分析副反應(yīng)及副反應(yīng)產(chǎn)物是推測(cè)終產(chǎn)品中雜質(zhì)類型和結(jié)構(gòu)的最為重要的途徑之一。例如:如在某結(jié)構(gòu)中引入反式雙鍵,如果采用Wittig反應(yīng),則可能會(huì)產(chǎn)生一定量的順式產(chǎn)物,該順式產(chǎn)物及其后續(xù)衍生物即成為終產(chǎn)品中可能存在的有關(guān)物質(zhì),需要進(jìn)行重點(diǎn)研究和控制。2.1.4其他普組合化合物通過(guò)對(duì)藥物本身的性質(zhì)的分析可以推測(cè)可能的降解產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)藥物中的不穩(wěn)定基團(tuán)和活潑基團(tuán)進(jìn)行分析,可以初步推測(cè)藥物的降解途徑和降解產(chǎn)物。如常見(jiàn)的酯鍵(包括內(nèi)酯)、酰胺鍵(包括內(nèi)酰胺)、季銨鍵等不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)以及酚羥基、噻吩基、吡啶基、醛基等活潑基團(tuán)都容易生成降解物。例如:二肽藥物甘氨酰-谷氨酰胺,在水溶液中易發(fā)生環(huán)合反應(yīng)生成環(huán)-(甘氨酰-谷氨酰胺),酰胺鍵水解后生成的谷氨酸還可能會(huì)生成雜質(zhì)焦谷氨酸,這些雜質(zhì)都是質(zhì)控研究的重點(diǎn)。甘氨酰-谷氨酰胺的降解途徑如圖2所示。再如:順苯磺阿曲庫(kù)銨結(jié)構(gòu)中有酯鍵和季銨基團(tuán),通過(guò)分析其結(jié)構(gòu)即可預(yù)測(cè)酯水解產(chǎn)物和Hofmann消除反應(yīng)產(chǎn)物是其主要的有關(guān)物質(zhì),需要進(jìn)行相應(yīng)的控制。順苯磺阿曲庫(kù)銨的降解途徑如圖3所示。2.2譜分析方法理論推導(dǎo)法僅僅是對(duì)藥物中可能存在的有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)最終還需要通過(guò)一系列的試驗(yàn)測(cè)定來(lái)確定。測(cè)定方法可分為直接測(cè)定法和間接測(cè)定法。直接測(cè)定法是直接從藥物中分離得到特定雜質(zhì),然后再像原料藥結(jié)構(gòu)確證一樣通過(guò)四譜分析來(lái)確定有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu),是確定有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的最直觀、最有效的手段之一,其優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確,提供的證據(jù)充分,如有可能應(yīng)盡可能進(jìn)行直接測(cè)定。但缺點(diǎn)是:費(fèi)時(shí)費(fèi)力,當(dāng)藥物中的雜質(zhì)種類較多、性質(zhì)接近時(shí),會(huì)給雜質(zhì)的分離純化工作帶來(lái)較大困難,而且當(dāng)雜質(zhì)的量較小時(shí)難以獲得充足的樣品進(jìn)行測(cè)定。有關(guān)物質(zhì)的獲得還可通過(guò)制備HPLC法和TLC法獲得,當(dāng)有關(guān)物質(zhì)的量較大或與主成分分離情況較好時(shí),還可以采用柱分離的方法或改變結(jié)晶條件的方法獲得?？梢蕴剿魍ㄟ^(guò)各種強(qiáng)制降解試驗(yàn)刻意增加某些雜質(zhì)的量,也可在合成研究中模擬最差工藝條件進(jìn)行合成,以獲得盡可能多的雜質(zhì)進(jìn)行下一步的研究工作。2.3雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的確定直接測(cè)定法適用于雜質(zhì)的量較大時(shí)進(jìn)行測(cè)定,當(dāng)樣品中的雜質(zhì)量較小,且雜質(zhì)的分離較為困難時(shí),可以通過(guò)間接測(cè)定法確定雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。需要指出的是:由于間接測(cè)定只能提供雜質(zhì)的部分信息,因而需要至少2種以上的間接證據(jù),并與理論推導(dǎo)法進(jìn)行結(jié)合才能初步確定化合物的結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)的最終確定仍需要富集一定量的雜質(zhì)進(jìn)行直接測(cè)定。間接測(cè)定有以下幾種方法。2.3.1峰保留時(shí)間法HPLC峰保留時(shí)間對(duì)比法對(duì)有關(guān)物質(zhì)的研究具有重要的意義。在雜質(zhì)量很小的情況下,我們首先可以推測(cè)有關(guān)物質(zhì)的可能結(jié)構(gòu),然后取預(yù)測(cè)的已知化合物與取含雜質(zhì)的藥物,在同樣的色譜條件下看已知化合物與該雜質(zhì)的保留時(shí)間是否一致。也可以取已知化合物添加入含雜質(zhì)的藥物中,在擬確定雜質(zhì)的峰面積是否有變化。HPLC峰保留時(shí)間法的另一個(gè)重要作用是“作標(biāo)記”,當(dāng)新藥的臨床前研究中顯示某特定雜質(zhì)在多批樣品中固定出現(xiàn),且在HPLC圖譜中位置相對(duì)固定,但尚不能完全確定其結(jié)構(gòu)時(shí),可將其作為“特定的非鑒定雜質(zhì)”,在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中用相對(duì)保留時(shí)間(RRT)表示該雜質(zhì)的情況,進(jìn)行后續(xù)的毒理學(xué)研究和臨床研究,不影響該藥物的研發(fā)向前推進(jìn)。待積累多批樣品的數(shù)據(jù)和一定量的樣品后再進(jìn)行定性研究。2.3.2紫外吸收測(cè)定UV法是利用二極管陣列檢測(cè)器,觀察擬定性有關(guān)物質(zhì)的紫外吸收情況,并測(cè)定該雜質(zhì)的最大吸收和最小吸收的數(shù)據(jù),初步確定該雜質(zhì)結(jié)構(gòu)中可能存在的官能團(tuán),也可以與已知化合物進(jìn)行紫外吸收情況的對(duì)比,為有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的最終確定提供有用信息。2.3.3雜質(zhì)信息的獲取液質(zhì)/氣質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/GC-MS)或毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)法是在不得到純的雜質(zhì)的情況下獲得的該雜質(zhì)的質(zhì)譜信息。LC/GC-MS和CE-MS是獲得雜質(zhì)信息的有效手段,也為定性分析提供較為可信的證據(jù)。通過(guò)LC-MS/GC-MS或CE-MS我們可以獲得各個(gè)雜質(zhì)的可能相對(duì)分子質(zhì)量,或進(jìn)一步通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜獲得各雜質(zhì)的裂解情況,為解析化合物的結(jié)構(gòu)提供直接證據(jù)。2.3.4傅立葉變換ir圖譜目前國(guó)外還有HPLC/TLC-FTIR和GC/LC-HMR等聯(lián)用技術(shù),在