疏肝飲煎劑對(duì)肝郁脾虛型腸易激綜合征大鼠的治療作用及對(duì)mo、cck的影響

疏肝飲煎劑對(duì)肝郁脾虛型腸易激綜合征大鼠的治療作用及對(duì)mo、cck的影響

腸易激綜合征（ibs）是一種腸動(dòng)力學(xué)和內(nèi)臟感覺異常的胃腸功能疾病。這是一組臨床表現(xiàn)為排便習(xí)慣改變（腹瀉和便秘）、糞便特性異常（稀疏便、粘膜便）、腹脹和腹痛的臨床表現(xiàn)的綜合征，其癥狀可能繼續(xù)存在或延遲。目前認(rèn)為它是一種生物-心理-社會(huì)病證,發(fā)病與內(nèi)臟感覺過(guò)敏、腦-腸軸的改變、胃腸動(dòng)力學(xué)的異常和精神行為的異常有關(guān)。目前治療缺乏確切而有效的辦法。中醫(yī)認(rèn)為腹瀉型IBS發(fā)病和肝郁脾虛、脾胃虛弱有關(guān),疏肝健脾的中藥復(fù)方疏肝飲煎劑在臨床上治療本病已取得較好療效。本實(shí)驗(yàn)以血漿和結(jié)腸黏膜中的胃動(dòng)素(MOT)、膽囊收縮素(CCK)為主要測(cè)定指標(biāo),以得舒特為陽(yáng)性對(duì)照藥,觀察復(fù)方疏肝飲煎劑對(duì)腹瀉型IBS模型大鼠的作用。1材料和方法1.1動(dòng)物和食物Wistar大鼠48只,清潔級(jí),雄性,體重(200±20)g。所有動(dòng)物在有恒定溫度、濕度及晝夜光線的房間里飼養(yǎng),自由進(jìn)食、進(jìn)水。1.2抑肽酶、agtrin肝素鈉注射液、25%烏拉坦(氨基甲酸乙酯)、甲醛溶液、冰醋酸,均為上海化學(xué)試劑一廠生產(chǎn)(批號(hào)分別為:000830,c20010110,990812,T20020710);抑肽酶(Aprotinin),美國(guó)Amresco(批號(hào):3212B60);得舒特(匹維溴安),法國(guó)蘇威制藥(批號(hào):0020)。膽囊收縮素試劑盒由第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室提供,胃動(dòng)素試劑盒由中國(guó)人民解放軍海軍放免技術(shù)中心提供。疏肝飲煎劑:由防風(fēng)、白芍藥、白術(shù)、陳皮、柴胡等藥物組成,按一定比例制成生藥濃度分別為1.50、0.75、0.45g/ml,備用;番瀉葉在沸水中浸泡15min后雙層紗布過(guò)濾,濾液減壓濃縮成生藥含量為0.6g/ml,備用。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1灌胃量ld50大鼠隨機(jī)分組為正常組、模型組、西藥組,以及大、中、小劑量中藥組,每組8只。正常組:正常喂食,自由飲水,不予任何處理;模型組:以蒸餾水灌胃(10ml/kg);西藥組:以1.5mg/ml的得舒特灌胃(15mg/kg);大劑中藥組:以1.50g/ml的疏肝飲煎劑灌胃(15g/kg);中劑中藥組:以0.75g/ml的疏肝飲煎劑灌胃(7.5g/kg);小劑中藥組:以0.45g/ml的疏肝飲煎劑灌胃(4.5g/kg)。1.3.2棉繩束縛大鼠的或排糞IBS動(dòng)物模型為脾虛加局部束縛刺激。所有動(dòng)物單只單籠飼養(yǎng)1周,開始實(shí)驗(yàn)。正常組不以任何處理,其余各組動(dòng)物以番瀉葉水煎劑(濃度為0.6g/ml,按15ml/Kg)灌胃,每日1次,持續(xù)兩周。從第二周起,給以束縛刺激。用粗制棉繩束縛大鼠的雙后肢,影響其正常行動(dòng),但不完全限制自由,被束大鼠可以拖后肢緩慢爬行。束縛持續(xù)1周,每天5h。束縛的最后兩天,束縛后將大張濾紙墊于籠下,計(jì)算5h內(nèi)的排便數(shù)以及糞便污染濾紙的直徑。藥物干預(yù)各組在第二周開始用藥,持續(xù)1周,束縛刺激在給藥后進(jìn)行。1.4指標(biāo)和方法的檢測(cè)檢測(cè)大鼠糞便的稀便級(jí),血漿中MOT、CCK的含量,結(jié)腸黏膜中MOT、CCK的含量,降結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)。1.4.1本例第4段1.4.2動(dòng)脈血與抑肽酶時(shí)間的測(cè)定大鼠以25%烏拉坦(0.5ml/100g體重)腹腔注射麻醉后,從腹主動(dòng)脈中采集動(dòng)脈血5ml,加入預(yù)冷的、加有1%肝素100μl(每毫升動(dòng)脈血20μl)和抑肽酶2500U(每毫升動(dòng)脈血500U)的塑料試管中,充分混勻后,立即在4℃以3000r/min離心15min。抽取上清液-70℃低溫保存待測(cè)。1.4.3移動(dòng)法提取距肛門5cm處向上剪取降結(jié)腸一段,長(zhǎng)約5cm,沿腸系膜剪開,4℃0.9%NaCl溶液中漂洗干凈,再置于沸騰的0.9%NaCl溶液中煮5min。刮取適量腸黏膜,稱重后將黏膜置于勻漿器內(nèi),并加入冰醋酸1ml充分勻漿,后轉(zhuǎn)入試管中,室溫下(25℃)靜置2h后加入氫氧化鈉1ml,中和醋酸。在4℃以3000r/min離心15min。抽取上清液-70℃低溫保存待測(cè)。1.4.4大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)檢測(cè)每組隨機(jī)選取2只大鼠,取其降結(jié)腸10%甲醛溶液固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學(xué)的變化。1.5比較owolsyndr機(jī)構(gòu)間差異的顯著性實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示。用t檢驗(yàn)IrritableBowelSyndrome比較兩組數(shù)據(jù)間差異的顯著性,one-wayANOVA檢驗(yàn)比較多組數(shù)據(jù)間差異的顯著性,P<0.05表示具有顯著性差異。2結(jié)果2.1藥物治療后血漿中mot、cck表達(dá)變化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,共死亡4只大鼠,分別為西藥組2只、中劑量中藥組1只、小劑量中藥組1只,其余存活狀況良好。結(jié)果表明,番瀉葉灌服聯(lián)合束縛刺激可明顯增加大鼠的稀便級(jí),與正常組相比有顯著性差異(P<0.01),表明該法可以制成大鼠腹瀉模型。經(jīng)得舒特治療后,稀便級(jí)有明顯下降,與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)。大劑量和中劑量疏肝飲藥物治療后稀便級(jí)得到改善(P<0.05),小劑量的治療效果不明顯。大劑量和中劑量的疏肝飲煎劑對(duì)稀便級(jí)的影響與西藥組相似(P>0.05)(表2)。2.2各組大鼠血漿中MOT、CCK含量的變化經(jīng)過(guò)束縛-制動(dòng)刺激聯(lián)合番瀉葉灌胃后,大鼠動(dòng)脈血血漿中MOT的含量幾乎沒有變化,與正常組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);藥物治療后各組對(duì)MOT含量變化的影響亦很小,正常、模型和各用藥組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。造模后大鼠血漿中CCK的含量大幅度降低,與正常組相比有顯著性差異(P<0.05);經(jīng)藥物治療一段時(shí)間后CCK含量較模型組明顯降低(P<0.05),疏肝飲煎劑各劑量間CCK含量的變化沒有顯著性差異,CCK含量降低的程度與疏肝飲用藥劑量間不存在明顯的依賴關(guān)系(表3)。2.3藥物治療對(duì)mot含量不高干預(yù)的療效判定經(jīng)過(guò)束縛-制動(dòng)刺激聯(lián)合番瀉葉灌胃后,大鼠結(jié)腸黏膜中MOT的含量亦幾乎沒有變化,藥物治療對(duì)MOT含量無(wú)明顯干預(yù)作用。而結(jié)腸黏膜中CCK模型組的含量較正常組明顯升高(P<0.05);經(jīng)得舒特和疏肝飲治療后CCK在黏膜中的含量下降,與正常組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05),說(shuō)明藥物有明顯的療效(表4)。2.4間質(zhì)及病理變化正常組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完好,上皮無(wú)剝脫,固有腺體無(wú)異常,間質(zhì)無(wú)充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等;模型組與正常組比較,除個(gè)別動(dòng)物間質(zhì)輕微充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)略明顯外,其余無(wú)特殊病理變化;各用藥組腸黏膜結(jié)構(gòu)基本完好,未見明顯充血水腫。3苦微寒—討論臨床上IBS的發(fā)生和心理精神的異常關(guān)系密切,異常精神生活可能通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)的改變導(dǎo)致胃腸道等由自主神經(jīng)控制的器官的功能紊亂,出現(xiàn)焦慮、強(qiáng)迫、抑郁等各種臨床癥狀。在中醫(yī)學(xué)理論中肝脾關(guān)系密切,肝的疏泄功能對(duì)脾胃的升清降濁之間的平衡有重要意義。一旦肝木有病,則“肝病必犯土,是侮其所勝也?？似t腹脹,便或溏或不爽……木郁不達(dá),風(fēng)木沖擊而賊脾土,則痛于臍下”(《臨證指南醫(yī)案》)?！夺t(yī)方考》認(rèn)為:“瀉責(zé)之于脾,痛責(zé)之于肝,肝責(zé)之于實(shí),脾責(zé)之于虛,脾虛肝實(shí),故令痛瀉?！备篂a型IBS最主要的癥狀是瀉前腹痛、瀉后痛減,基本病機(jī)在于肝郁脾虛。由此我們采用以番瀉葉灌胃建立大鼠脾虛模型,結(jié)合束縛刺激而成的IBS動(dòng)物模型以泄瀉為主要癥狀,且伴有煩躁、抑郁、焦慮等變化,與腹泄型IBS臨床癥狀相似。本實(shí)驗(yàn)使用的疏肝飲煎劑是以疏肝健脾為法,在古代名方痛瀉要方的基礎(chǔ)上加一味柴胡按一定比例組成。歷代醫(yī)家均以痛瀉要方治療腸鳴腹痛、瀉后痛減的痛瀉之癥。中醫(yī)臨床上治療肝郁脾虛型IBS多選本方。其中白術(shù)有“濕去而瀉止,瀉止而脾健,脾健而胃亦健”之功。白芍藥酸苦微寒,平肝柔肝緩急止痛,“其功全在平肝,肝平則不克脾胃,而臟腑各安……瀉痢自去,痢痛自安矣”。防風(fēng)辛溫,散肝醒脾,且有勝濕之功。陳皮辛溫,理氣健脾燥濕,尚能行氣止痛。在上述藥物的基礎(chǔ)上,加入苦微寒之柴胡一味,功在疏肝解郁和中。胃腸運(yùn)動(dòng)主要受腸神經(jīng)系統(tǒng)的支配及體液因素的影響。胃腸激素是調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的重要激素,它通過(guò)干擾胃腸道的動(dòng)力與分泌吸收功能,以及對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用而對(duì)IBS產(chǎn)生一定的影響。目前認(rèn)為與IBS關(guān)系較為密切的胃腸激素有MOT、CCK、血管活性腸肽(VIP)、生長(zhǎng)抑素(SS)、P物質(zhì)(SP)、五羥色胺(5-HT)等。產(chǎn)生MOT的細(xì)胞成為M0細(xì)胞,主要存在于十二指腸和近端空腸黏膜隱窩,以及消化道組織的黏膜下層和肌層的神經(jīng)組織中。它的生理功能是調(diào)節(jié)胃腸、膽囊、食管的運(yùn)動(dòng),促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)和胃腸道對(duì)水、電解質(zhì)的運(yùn)輸,主要通過(guò)直接作用于消化道平滑肌細(xì)胞上的受體,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高進(jìn)而引起強(qiáng)烈的刺激上消化道的機(jī)械運(yùn)動(dòng)和電活動(dòng)的作用而實(shí)現(xiàn)。MOT和IBS的關(guān)系各家說(shuō)法不一,這可能與胃動(dòng)素分泌影響因素的眾多以及空腹時(shí)血中含量呈周期性變化有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,血漿中MOT的含量在正常大鼠和應(yīng)激大鼠之間并無(wú)明顯異常,但在降結(jié)腸黏膜組織中,正常組和各用藥組都可以測(cè)到MOT的存在,但各組間沒有顯著性差異。本實(shí)驗(yàn)的各組動(dòng)物中血漿和結(jié)腸黏膜中MOT的變化沒有很好的規(guī)律性,可能是與MOT的周期性變化和影響因素眾多有關(guān)。CCK以多種激素形式存在于血漿和胃腸組織中,它的主要作用是促使膽囊和胃腸平滑肌興奮收縮。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)CCK的具體作用機(jī)制研究不多,國(guó)外有報(bào)道稱IBS患者空腹時(shí)血漿中CCK水平明顯高于正常人,而局部結(jié)腸組織中含量幾乎為零。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組CCK在血漿中含量較正常組為低(P<0.05)。同時(shí)結(jié)腸黏膜組織中各組CCK含量均不為零,模型組反而較正常組為高,兩者之間有顯著性差異。血漿中和腸道黏膜組織中CCK的含量變化的不一致性,可能是由于兩者產(chǎn)生來(lái)源的不同所致。腸道黏膜中含有CCK的釋放細(xì)胞,對(duì)于應(yīng)激等外來(lái)刺激可以直接產(chǎn)生反饋,使大鼠腸道敏感性增加,CCK分泌增多,這種反饋性增多主要在局部組織起作用,所以血漿中含量的影響相對(duì)較小。得舒特作用是否與調(diào)整胃腸激素的水平有關(guān)尚無(wú)完整報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)中得舒特可以改善IBS患者某些激素水平升高的情況,尤其是結(jié)腸黏膜中的CCK的含量。疏肝飲可以降低結(jié)腸黏膜中CCK的含量,但大中小各劑量之間,沒有呈現(xiàn)出很好的量