近海海泥鏈霉菌分離條件的研究

近海海泥鏈霉菌分離條件的研究

海洋微生物的棲息地與地球追蹤微生物非常不同，因此與地球突變微生物產(chǎn)生的一些特定的生物活性物質(zhì)不同。其生物活性物質(zhì)種類(lèi)包括新型抗生素、抗癌藥物、不飽和脂肪酸、酶、酶抑制劑、維生素等,這些活性物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)豐富多樣、分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特新穎、具有極大的藥用潛力。放線菌是產(chǎn)生抗生素等活性物質(zhì)種類(lèi)最多的一類(lèi)微生物,其中又以鏈霉菌(Streptomyces)為主。目前在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域,有2/3的抗生素來(lái)源于鏈霉菌,因此,從海洋鏈霉菌中尋找生物活性物質(zhì)并開(kāi)發(fā)研究特效藥物是前途廣闊、易獲得重大科研成果的新領(lǐng)域。海洋鏈霉菌資源的開(kāi)發(fā),關(guān)鍵的一步是將海洋中的資源菌株分離出來(lái)。調(diào)查表明:在近海區(qū),海洋放線菌與陸棲放線菌相似,也是以鏈霉菌占優(yōu)勢(shì),但因其生長(zhǎng)環(huán)境不同,其分離技術(shù)也有所不同。因此,我們對(duì)近海海泥中鏈霉菌的分離技術(shù)作如下研究。1材料和方法1.1海洋污泥的收集經(jīng)初步試驗(yàn),選擇含鏈霉菌豐富的海洋泥樣No20(采自廣東電白博賀近海)、No41(采自廣東陽(yáng)江閘坡近海)供試。1.2培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基:高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基、精氨酸甘油瓊脂培養(yǎng)基、察氏瓊脂培養(yǎng)基、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基、黃豆粉瓊脂培養(yǎng)基,以及改良HV瓊脂培養(yǎng)基(g/L):新鮮海泥浸提液200ml、Na2HPO40.5g、KCl1.7g、瓊脂15g。以上培養(yǎng)基以采自廣東電白博賀近海陳海水配制好后滅菌備用。1.3平板的制備稱(chēng)取海泥樣品1g,加入含玻璃珠的10ml無(wú)菌海水,激烈振蕩制成均勻的混懸液,靜置20min,取上清液逐級(jí)稀釋為10-2、10-3、10-4和10-5,各取0.2ml,分別涂平板,每處理4個(gè)重復(fù)。28℃培養(yǎng)7～10d,觀察分離結(jié)果,并記錄。2結(jié)果與分析2.1高氏代酸鹽管將采集的新鮮海泥取樣兩份,一份密閉置于4℃冰箱內(nèi)保存,另一份在28℃條件下自然風(fēng)干,用高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基分離鏈霉菌。海泥經(jīng)風(fēng)干后,鏈霉菌的數(shù)量下降較少,而細(xì)菌的數(shù)量急劇下降(表1)。2.2種方法所需時(shí)間分離前,對(duì)土樣進(jìn)行熱處理可活化鏈霉菌孢子,提高鏈霉菌分離數(shù)量。其方法一般是直接處理土樣,這種方法所需時(shí)間較長(zhǎng)。我們?cè)O(shè)計(jì)在泥樣劇烈振蕩混勻后,于不同溫度水浴里靜置處理土壤懸液20min,再用同溫度的無(wú)菌海水進(jìn)行稀釋。分離結(jié)果見(jiàn)表2:40℃處理土壤懸浮液20min可顯著提高鏈霉菌的分離數(shù)量;50℃時(shí),鏈霉菌的出菌率下降,當(dāng)處理溫度升到60℃時(shí),分離到的鏈霉菌數(shù)量極少。2.3培養(yǎng)基上鏈霉菌種類(lèi)及數(shù)量將風(fēng)干的土樣制成土壤懸浮液,于40℃水浴中熱處理20min,稀釋后接于不同培養(yǎng)基中分離鏈霉菌,并根據(jù)鏈霉菌基絲、氣絲和可溶性色素等特征初步確定鏈霉菌的種類(lèi)數(shù)。由表3可見(jiàn):高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基上分離的鏈霉菌種類(lèi)和數(shù)量最多,改良HV瓊脂次之,且兩種培養(yǎng)基分離的鏈霉菌種類(lèi)包括了其他4種培養(yǎng)基上的全部類(lèi)型。改良HV瓊脂培養(yǎng)基上鏈霉菌種類(lèi)多于高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基。另外改良HV瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)量最少,高氏一號(hào)瓊脂次之,這兩種培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)量對(duì)鏈霉菌挑取干擾不大。而黃豆粉瓊脂培養(yǎng)基上鏈霉菌的出菌率最低,且細(xì)菌數(shù)量最多。說(shuō)明利用高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基和改良HV瓊脂培養(yǎng)基,可以從泥樣中分離出大部分鏈霉菌,且細(xì)菌干擾小,一般不影響鏈霉菌的挑取。2.4不同海水濃度的土壤污染物分離結(jié)果以高氏一號(hào)瓊脂作為分離培養(yǎng)基,陳海水濃度分別為0、20%、40%、60%、80%和100%,泥樣經(jīng)風(fēng)干處理,土壤懸浮液經(jīng)40℃水浴20min,分離結(jié)果見(jiàn)表4。海水濃度在60%～80%時(shí),出菌率高于100%海水。尤其是土樣No41海水濃度60%時(shí)分離的鏈霉菌數(shù)量比100%海水增加近20%。當(dāng)海水濃度下降到40%以下時(shí),鏈霉菌的分離數(shù)量明顯下降。近海海水經(jīng)常被流入的江水和雨水稀釋,鹽度降低,因此近海泥樣中的鏈霉菌適應(yīng)相對(duì)低鹽度環(huán)境。2.5nacl濃度對(duì)鏈霉菌的出菌率用海水配制的培養(yǎng)基對(duì)鏈霉菌的分離效果較好,但有時(shí)海水的采集有一定的難度。本試驗(yàn)用一定濃度的NaCl溶液取代海水做了初步研究。以高氏一號(hào)瓊脂作為分離培養(yǎng)基,NaCl濃度分別設(shè)為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,3.5%和4.0%,以純海水作對(duì)照,泥樣經(jīng)風(fēng)干處理,土壤懸浮液經(jīng)40℃水浴20min,分離結(jié)果見(jiàn)表5。NaCl濃度在2%～3%范圍內(nèi)鏈霉菌的出菌率較高。當(dāng)NaCl濃度增加到3.5%時(shí),鏈霉菌數(shù)量明顯下降。另外,研究結(jié)果顯示用海水配制培養(yǎng)基的分離效果明顯高于NaCl配制的培養(yǎng)基。3不同培養(yǎng)基對(duì)鏈霉菌的分離效果將海泥泥樣進(jìn)行風(fēng)干處理,用高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基及改良HV瓊脂培養(yǎng)基分離鏈霉菌時(shí),極少有真菌污染,對(duì)鏈霉菌的出菌率的影響不大,但細(xì)菌的數(shù)量顯著減少,大大有利于鏈霉菌的挑取,可以不使用抑制劑就達(dá)到很好的分離效果。其原因是細(xì)菌對(duì)干燥比較敏感,而鏈霉菌的孢子比較耐干燥,因此風(fēng)干處理后,土樣中水分丟失,使大量細(xì)菌失去活力。用40℃水浴處理土壤懸浮液20min,可促進(jìn)鏈霉菌孢子的萌發(fā),增加鏈霉菌的出菌率?？梢?jiàn),用水浴處理可達(dá)到司美茹等報(bào)道的對(duì)土樣進(jìn)行熱處理促進(jìn)孢子萌發(fā)的相同效果,又減少了處理時(shí)間,提高了效率。高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基和改良HV瓊脂培養(yǎng)基對(duì)鏈霉菌的分離效果較好,且培養(yǎng)基上的細(xì)菌量少。我們?cè)诜蛛x鏈霉菌的過(guò)程中發(fā)現(xiàn),同樣重量的近海海泥中的鏈霉菌和細(xì)菌數(shù)量要比土壤中的少很多,這與林麗玉等報(bào)道的一致。配制分離培養(yǎng)基時(shí),海水的含量在60%～80%范圍內(nèi),鏈