ITC等溫滴定量熱法的操作說明資料

等溫滴定量熱法

(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)2023-10-132IsothermalTitrationCalorimetry,ITC等溫滴定量熱技術(shù)〔ITC〕是一種監(jiān)測(cè)由結(jié)合成分的添加而起始的任何化學(xué)反響的熱力學(xué)技術(shù)，即用一種反響物滴定另一種反響物，隨著參與滴定劑的數(shù)量的變化，測(cè)量反響體系溫度的變化它通過高靈敏度、高自動(dòng)化的微量量熱儀連續(xù)、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)和記錄一個(gè)變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時(shí)供給熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息，它已經(jīng)成為鑒定生物分子間相互作用的首選方法?？色@得生物分子相互作用的完整熱力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合常數(shù)〔Ka〕、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)〔n〕、摩爾結(jié)合焓〔△H〕、摩爾結(jié)合熵〔△S〕、摩爾恒壓熱容〔△Cp〕，和動(dòng)力學(xué)參數(shù)(如酶促反響的Km和kcat〕3獨(dú)特特點(diǎn)：它對(duì)被爭(zhēng)論體系的溶劑性質(zhì)、光譜性質(zhì)和電學(xué)性質(zhì)等沒有任何限制條件，即具有非特異性的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，樣品用量小，方法靈敏度和準(zhǔn)確度高(儀器最小可檢測(cè)熱功率2nW，最小可檢測(cè)熱效應(yīng)0.125uJ，生物樣品最小用量0.4ug，溫度范圍2℃-80℃，滴定池體積(1.43ml)。試驗(yàn)時(shí)間較短(典型的ITC試驗(yàn)只需30-60分鐘，并加上幾分鐘的響應(yīng)時(shí)間)，操作簡(jiǎn)潔(整個(gè)試驗(yàn)由計(jì)算機(jī)把握，使用者只需輸入試驗(yàn)的參數(shù)，如溫度、注射次數(shù)、注射量等，計(jì)算機(jī)就可以完成整個(gè)試驗(yàn)，再由Origin軟件分析ITC得到的數(shù)據(jù))。測(cè)量時(shí)不需要制成透亮清亮的溶液,而且量熱試驗(yàn)完畢的樣品未遭破壞，還可以進(jìn)展后續(xù)生化分析。盡管微量熱法缺乏特異性但由于生物體系本身具有特異性，因此這種非特異性方法有時(shí)可以得到用特異方法得不到的結(jié)果，這有助于覺察新現(xiàn)象和新規(guī)律，特殊適應(yīng)于爭(zhēng)論生物體系中的各種特異過程。4Applicationsinclude:CharacterizationofmolecularinteractionsofsmallmoleculesLeadoptimization.Enzymekinetics.Assessmentoftheeffectofmolecularstructurechangesonbindingmechanisms.Assessmentofbiologicalactivity.56在恒溫下，注射器中的“配體”溶液滴定到包含“高分子”溶液的池中。當(dāng)配體注射到池中，兩種物質(zhì)相互作用，釋放或吸取的熱量與結(jié)合量成正比。當(dāng)池中的高分子被配體飽和時(shí)，熱量信號(hào)減弱，直到只觀看到稀釋的背景熱量。7ITC系統(tǒng)是通過細(xì)胞反響網(wǎng)絡(luò)CFB來分別測(cè)量或者補(bǔ)償樣品和比照由于反響所產(chǎn)生或者吸取的熱量。兩個(gè)硬幣狀的東西放置在絕熱的圓筒中，通過那個(gè)細(xì)細(xì)的管子與外界聯(lián)通。有兩個(gè)熱量檢測(cè)裝置。一個(gè)用來檢測(cè)兩個(gè)樣品之間的熱量差，另一個(gè)檢測(cè)比照和環(huán)境的熱量差。當(dāng)樣品中發(fā)生化學(xué)反響的時(shí)候，釋放或者吸取熱量，因此樣品和比照的溫度差會(huì)通過對(duì)樣品進(jìn)展增加或者削減熱量而穩(wěn)定在一個(gè)水平，就是baseline。因此那些用來維持ΔT1=常數(shù)的熱量就被系統(tǒng)檢測(cè)畫作曲線。89滴定一般在盡可能接近絕熱的條件下進(jìn)展，被滴定物可以是液體或懸浮的固體；滴定劑可以是液體或氣體。溫度變化是由滴定劑與被滴定物間的化學(xué)作用或物理作用〔例如一種有機(jī)分子吸附于固體外表〕引起的。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以熱譜圖形式表示，它供給了有關(guān)反響中物質(zhì)的量〔滴定終點(diǎn)〕和反響物質(zhì)的特性〔焓變〕的數(shù)據(jù)。對(duì)圖進(jìn)展分析，可以得知反響容器中發(fā)生的反響的類型和數(shù)目，以及溶液中存在的各物種的濃度等信息。這局部內(nèi)容稱為熱滴定，同時(shí)還可以確定反響的化學(xué)計(jì)量關(guān)系，計(jì)算反響的熱力學(xué)量,如平衡常數(shù)K(ΔG°)、標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的焓變?chǔ)°和熵變?chǔ)°,這局部內(nèi)容稱為滴定量熱法。測(cè)溫滴定法以熱效應(yīng)為根底,與溶液的很多性質(zhì)(如粘度、光學(xué)透亮度、介電常數(shù)、溶劑強(qiáng)度、以及離子強(qiáng)度等)無關(guān),因此可以用于氣相、液相、非水溶液、有色溶液、膠體溶液和粘稠漿狀等體系。10典型的ITC數(shù)據(jù)配體溶液20次注射到ITC池的蛋白溶液中。每個(gè)注射峰〔上圖〕下方的區(qū)域與注射所釋放的總熱量相等。當(dāng)這種綜合的熱量相對(duì)添加到池中的配體摩爾比作圖時(shí)，就獲得了相互作用的完整結(jié)合等溫線〔以以下圖〕。用單位點(diǎn)模型來驗(yàn)證數(shù)據(jù)?；瘜W(xué)計(jì)量、結(jié)合常數(shù)及焓的數(shù)值都顯示在框內(nèi)。1112ITC法測(cè)量結(jié)合/解離常數(shù)ITC可以直接測(cè)量焓變△H，結(jié)合常數(shù)Ka，而不對(duì)反響體系產(chǎn)生影響，也不引入修飾基團(tuán)，因此測(cè)得的結(jié)果更加可信131415〔△G〕與總的結(jié)合親和力直接相關(guān)，但不能了解結(jié)合機(jī)理。ITC供給了〔△G〕以及〔△H〕和〔△S〕，產(chǎn)生了結(jié)合機(jī)理的真實(shí)圖像。作用機(jī)理爭(zhēng)論與分析開發(fā)16ITC：用生物相關(guān)模型系統(tǒng)架起橋梁ITC的