還原型谷胱甘肽的快速測(cè)定方法

還原型谷胱甘肽的快速測(cè)定方法

谷胱甘肽的檢測(cè)氨基葡萄糖（gsh）廣泛存在于生物中。這是一種具有重要生理功能的活性三醇。它具有獨(dú)特的抗逆性、抗衰老性和多種獨(dú)特的抗衰老性。廣泛應(yīng)用于食品、藥物、保健品和保健品行業(yè)。GSH分子中含有一個(gè)活潑的巰基,易被氧化脫氫,兩分子GSH失氫后轉(zhuǎn)變?yōu)橐环肿友趸凸入赘孰?GSSG)?？偣入赘孰?GSH+GSSG)的測(cè)量方法有高效液相色譜法、Tietze改良的DTNB[5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)]法、mBBr(-溴代胺熒光)標(biāo)記法。還原型谷胱甘肽分子中含有巰基,按照巰基的測(cè)定方法可以求出GSH的含量,GSH的測(cè)定方法有四氧嘧啶法、亞硝基鐵氰化鈉法、熒光法等。本文改進(jìn)并比較了三種以巰基反應(yīng)為原理的GSH測(cè)定方法:四氧嘧啶法、亞硝基鐵氰化鈉法以及DTNB法。1實(shí)驗(yàn)方法1.1gsh及其試劑菌株釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)L-3,L-184,YL-11,YL-13,由中科院微生物研究所酵母菌分子遺傳與育種研究組提供。GSH提取液利用溫差破碎法提取GSH。酵母發(fā)酵液4000r/min離心5min,收集菌體,菌體加水→-20℃冰凍過(guò)夜→沸水浴煮沸5min→離心→上清液用于測(cè)定。GSH標(biāo)準(zhǔn)品和DTNB購(gòu)自華美生物工程公司;5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(簡(jiǎn)稱DTNB)和四氧嘧啶(ALLOXAN試劑)由sigma分裝。其它試劑均為分析純。1.2ph值和dtnb分析1.5%亞硝基鐵氰化鈉溶液,用飽和硫酸銨溶液配制,此試劑僅能保存一周;8mol/LNH4OH;固體硫酸銨;0.1mol/L四氧嘧啶溶液,冰凍保存;0.1mol/LNaOH(此液必須與0.1mol/L四氧嘧啶校驗(yàn)。即此液3mL加0.1mol/L四氧嘧啶3mL,此時(shí)pH值應(yīng)為7.5);pH值7.5的0.5mol/L磷酸鹽緩沖液;1mol/LNaOH;0.15molNaOH;0.5molTris-HCl緩沖液;3%甲醛溶液,用NaOH調(diào)節(jié)pH值12;0.01mol/LDTNB溶液由生化試劑加pH值7的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液配制,存于棕色瓶中,放于低溫暗處備用;DTNB分析溶液由0.01mol/LDTNB溶液和pH值為8的0.5molTris-HCl緩沖液的體積比1∶100配制而成,臨用前配制。主要儀器UV-3000分光光度計(jì)(日本島津);722光柵分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠);pHS-3C精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。1.3方法1.3.1改進(jìn)的程序法GSH在NH4OH存在下,與亞硝基鐵氰化鈉發(fā)生巰基反應(yīng),生成紅色化合物。測(cè)定中加入硫酸銨可以增加顏色反應(yīng)的強(qiáng)度。具體操作參照文獻(xiàn),稍作改進(jìn)如下:在測(cè)定管中加入1.0g硫酸銨粉末(以使體系中硫酸銨達(dá)到過(guò)飽和),1mL分析樣品,3mL硫酸銨飽和溶液,搖勻。加入0.5mL亞硝基鐵氰化鈉試劑,隨即加入0.7mL8mol/L的NH4OH溶液,混合,立即用分光光度計(jì)在525nm進(jìn)行比色,讀取各管光密度。通過(guò)計(jì)算或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出GSH濃度。1.3.2改進(jìn)的四氧吡啶法GSH在實(shí)驗(yàn)條件下與四氧嘧啶作用的生成物在305nm有最高吸收峰,本法也稱四氧嘧啶305法。具體操作參照文獻(xiàn),稍作改進(jìn)如下:在測(cè)定管中加入1mL分析樣品,1mL0.1mol/L的四氧嘧啶溶液,混合,加入0.5molpH值7.5磷酸鹽緩沖液和0.1mol/LNaOH溶液各1mL,隨即混合。計(jì)時(shí)開(kāi)始6min,加入1mol/LNaOH溶液,混合后,用紫外分光光度計(jì)在305nm測(cè)定光密度,讀取各管讀數(shù)。通過(guò)計(jì)算或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出GSH濃度。1.3.3方法的改進(jìn)設(shè)計(jì)GSH和DTNB反應(yīng)生成黃色的5-硫代-2硝基苯甲酸,在412nm波長(zhǎng)有最大吸收峰。具體操作按照文獻(xiàn)所報(bào)道的方法進(jìn)行,本文稍作改進(jìn)如下:將分析樣品0.5mL加入1.5mL0.15mol/LNaOH溶液中,搖勻,加入體積分?jǐn)?shù)φ=0.03甲醛0.5mL,搖勻,靜置2min。加入2.5mLDTNB分析溶液,搖勻,在25℃水浴保溫5min,測(cè)定在波長(zhǎng)412nm處的吸光度A,通過(guò)計(jì)算或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出相應(yīng)GSH濃度。2結(jié)果與討論2.1gsh蛋白提取鑒于文獻(xiàn)中測(cè)定的是血液中GSH的濃度,因此采用亞硝基鐵氰化鈉法和四氧嘧啶法在測(cè)定前需用三氯乙酸或偏磷酸除去蛋白。本文主要是為了測(cè)定酵母提取液中GSH的濃度,在提取GSH時(shí)采用溫差破碎細(xì)胞,酵母中的蛋白可以以沉淀形式除去,離心后GSH提取液中已經(jīng)不含有蛋白。因此可以省略原方法中三氯乙酸或偏磷酸除蛋白的過(guò)程,原測(cè)定步驟也相應(yīng)簡(jiǎn)化。在文獻(xiàn)報(bào)道的DTNB法中,GSH質(zhì)量濃度在0.19～0.95g/L之間線性關(guān)系良好,本文要測(cè)的酵母提取液中GSH的濃度不在這一線性范圍內(nèi),為了能夠測(cè)定GSH質(zhì)量濃度低于0.2g/L的樣品,采取以下措施:增大測(cè)定體系中GSH待測(cè)液的體積分?jǐn)?shù),即從原來(lái)的0.03增加到0.1,以獲得更大的靈敏度。改進(jìn)后的具體操作方法見(jiàn)前文方法部分。2.2不符合分布規(guī)定的情形下,有符合以下情況根據(jù)三種方法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,其相應(yīng)的回歸方程見(jiàn)表1。三種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均較高,其中四氧嘧啶法和DTNB法能夠達(dá)到0.999以上。四氧嘧啶法的靈敏度最高,DTNB法次之,DTNB法經(jīng)本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)后,其靈敏度比原先提高了三倍。在顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,考察光密度隨時(shí)間的變化情況,結(jié)果表明在亞硝基鐵氰化鈉法中,GSH在反應(yīng)顯色后生成的色澤很不穩(wěn)定,顯色后光密度在30s即見(jiàn)降低,因此要求在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成測(cè)定,這給操作的平行性帶來(lái)一定的難度。四氧嘧啶法和DTNB法中,反應(yīng)顯色后30min以內(nèi)光密度未見(jiàn)降低,顯色穩(wěn)定。2.3各種方法對(duì)gsh測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和半胱氨酸不干擾本文分別選擇兩種待測(cè)體系比較這三種測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度。(a)待測(cè)液為已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)GSH溶液;(b)待測(cè)液為已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)GSH和與其等濃度的L-半胱氨酸溶液的混合液。(b)的選擇主要是為了考察酵母提取液中的其它成分對(duì)GSH測(cè)定的的影響。計(jì)算每種方法的相對(duì)誤差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)對(duì)已知濃度的GSH的測(cè)定,本文發(fā)現(xiàn)在這兩種待測(cè)體系中采用四氧嘧啶法和DTNB法進(jìn)行測(cè)定,相對(duì)誤差可以控制在2%以內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均可以控制在4%以內(nèi),說(shuō)明這兩種方法的準(zhǔn)確度和精密度較高,且半胱氨酸不干擾測(cè)定結(jié)果。四氧嘧啶法中,GSH的巰基與四氧嘧啶發(fā)生反應(yīng)使305nm有最高吸收峰,半胱氨酸的巰基也可能與四氧嘧啶發(fā)生反應(yīng),但其吸收峰在275nm,不會(huì)干擾GSH的測(cè)定。DTNB法中,由于甲醛在堿性溶液中會(huì)將半胱氨酸掩蔽,因此可以避免半胱氨酸的干擾。但甲醛濃度過(guò)高或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)使GSH的測(cè)定受到影響,各實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)溶液中半胱氨酸的量決定甲醛的濃度和反應(yīng)時(shí)間。亞硝基鐵氰化鈉法中,半胱氨酸的存在會(huì)嚴(yán)重干擾GSH的測(cè)定,使測(cè)定值明顯偏高。2.4回收率的測(cè)定在試樣中,加入一定量的待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),然后與原試樣同時(shí)進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得結(jié)果之差應(yīng)等于加入的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量。通過(guò)回收率的測(cè)定,可以檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度和試樣所引起的干擾誤差。用標(biāo)準(zhǔn)GSH加入法分別對(duì)不同酵母提取液樣品進(jìn)行了回收實(shí)驗(yàn),按下式計(jì)算回收率。式中,w0為試樣中原有GSH的質(zhì)量分?jǐn)?shù);w為試樣中加入標(biāo)準(zhǔn)GSH的質(zhì)量分?jǐn)?shù);w1為試樣中加入標(biāo)準(zhǔn)GSH后測(cè)得的被測(cè)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。三種測(cè)定方法的回收率如表3,4,5所示。2.5酵母提取液的gsh測(cè)定用這三種方法分別測(cè)定釀酒酵母L-3,L-184,YL-11,YL-13的提取液中GSH的質(zhì)量濃度,測(cè)定結(jié)果如表6所示。從表6可以看出,三種方法對(duì)酵母提取液中GSH的測(cè)定結(jié)果基本一致,其中亞硝基鐵氰化鈉法的測(cè)定值要稍高于四氧嘧啶法和DTNB法,原因可能是酵母提取液中含有少量的半胱氨酸等含巰基物質(zhì),而亞硝基鐵氰化鈉法不能避免含巰基物質(zhì)的干擾。四氧嘧啶法和DTNB法的測(cè)定結(jié)果非常接近,這兩種方法可以快速準(zhǔn)確的測(cè)定出酵母提取液中GSH的含量。3gsh的合成綜上所述,改進(jìn)后這三種方法能夠快速且準(zhǔn)確的測(cè)定GSH,尤其是四氧嘧啶法和DTNB法的精密度和準(zhǔn)確度較高,顯色穩(wěn)定,數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好,能夠避免半胱氨酸等