薏苡仁多糖提取工藝優(yōu)化及其凝膠柱層析特性研究

薏苡仁多糖提取工藝優(yōu)化及其凝膠柱層析特性研究

愛斯基亞是英國的名字叫托吡西亞。這是水稻科的一種干燥成熟的種子。它也被稱為“皇家海軍”、“回回米”和“六谷米”?！侗静菥V目》中提及薏苡仁“健脾益胃、補肺清熱、祛風勝溫、強筋骨”。薏苡在我國大部分地區(qū)均有種植,主要產于福建、河北、遼寧等地。國內對薏苡仁的開發(fā)利用極為重視,我國主要對薏苡仁酯做了大量研究工作,并且已經被康萊特公司研制成抗腫瘤的注射液等產品,在臨床上以得到廣泛應用,提取薏苡仁油以后的殘渣常棄之不用或用作飼料。薏苡仁中含有較多的多糖,目前對薏苡仁多糖提取分離純化研究較少且多糖的得率不高。其多糖已被證實具有降血糖、提高免疫力等作用。本實驗以提油后的薏苡仁渣為原料進行多糖的提取和分離純化的初步研究,一方面旨在提高薏苡仁的綜合利用,另一方面為薏苡仁多糖的進一步研究開發(fā)提供更多的參考數據。1材料和方法1.1各組分的分析純薏苡仁(產地:浙江)南昌匯仁集團有限公司。石油醚(60~90℃)、丙酮、乙醚、95%乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、氯仿、正丁醇、30%雙氧水、NaOH、濃HCl、淀粉酶、糖化酶、DEAE-52、SephadexG-75等(均為分析純)。1.2儀器、儀器和儀器B-260恒溫水浴鍋上海亞龍生化儀器廠;電子天平上海良平儀器儀表有限公司;KQ5200超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責任有限公司;RE52CS-1旋轉蒸發(fā)儀上海亞龍生化儀器廠;GZX-DH-40X-45S電熱恒溫干燥箱上海躍進醫(yī)療器械廠;T6新世紀紫外分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;JB-3磁力攪拌器上海電磁新涇儀器有限公司。1.3椰子糖提取技術的優(yōu)化1.3.1椰子糖提取工藝薏苡仁→篩選→粉碎→脫脂→熱水提取→離心→上清液→濃縮→醇沉→干燥→薏苡仁粗多糖1.3.2提取淀粉的制備挑選籽粒飽滿、色澤潔白、無蟲蛀、無霉斑的薏苡仁充分干燥后置于超微粉碎機中,粉碎過篩。每份稱取5g,用石油醚脫脂后,置于三角瓶中,加蒸餾水調節(jié)pH5.2,于100℃水浴鍋中提取。按20IU/g加淀粉酶到提取液中,直到碘檢不變色;接著按18IU/g加糖化酶,水浴溫度50~60℃,pH6.5處理1h,以去除淀粉。100℃水浴條件下滅酶10min,然后在3000r/min下離心10min,上清液經減壓濃縮,加入4倍濃縮液體積的95%乙醇醇沉過夜,干燥沉淀得薏苡仁粗多糖。1.3.3u3000解決文獻取苯酚100g,加鋁片0.1g和碳酸氫鈉0.05g,常壓蒸餾,收集182℃餾分。稱取該餾分5g,置100mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度,搖勻后,置棕色試劑瓶中,冰箱中冷藏儲存?zhèn)溆谩?.3.3.對照品溶液的制備精密稱取80℃干燥至質量恒定的葡萄糖10mg于100mL容量瓶中,加水至刻度,搖勻即為質量濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標準工作液。精密量取葡萄糖對照品溶液(0.1mg/mL)0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL分別置于干燥試管中,各加水至1.00mL,再分別加苯酚試劑0.50mL,搖勻,在冷水浴中迅速滴加硫酸2.50mL,即刻搖勻后放置10min,然后放置沸水浴加熱10min,迅速冷卻到室溫。以1.0mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白,于488nm波長處測定A值,以橫坐標為葡萄糖質量、縱坐標為吸光度,繪制標準曲線。1.3.3.多糖含量的測定精確稱取60℃干燥至質量恒定的實驗室精制薏苡仁多糖10mg,水溶解后定容到100mL容量瓶中,搖勻,作為多糖儲備液。精確量取多糖儲備液1mL,定容至l0mL,取0.5mL加水至1mL,按測定標準曲線同樣的方法測其吸光度。按下式計算換算因子:式中:m為多糖質量/mg;C為多糖液中葡萄糖的質量濃度/(mg/mL);D為多糖的稀釋因子。1.3.3.4-椰子糖的計算提取液按上述操作顯色,測得吸光度,由葡萄糖標準曲線查得多糖質量,并換算多糖得率。1.3.4正交試驗設計在全面考察提取溫度、時間、pH值、提取次數、料液比、原料粉碎度的基礎上,選擇提取時間、提取溫度、料液比3項為考察因素,各取3個水平,正交因素水平表(表1),進行L9(33)正交試驗設計。1.4杏仁糖的分離和提取1.4.1精制薏養(yǎng)殖仁多糖薏苡仁粗多糖→脫脂→Sevag法脫蛋白→H2O2脫色→透析→DEAE-52柱層析→SephadexG-75凝膠柱層析→精制薏苡仁多糖1.4.2薏養(yǎng)殖仁多糖的制備精確稱取粗多糖5g,溶于30mL蒸餾水中配成粗多糖溶液,在粗多糖液中加入(4倍體積)120mL的無水石油醚,振蕩后,靜置1h,溶液分為上下兩層,除去上層石油醚層,下層水溶液按上述步驟重復3次,最后得到脫脂的薏苡仁多糖液。1.4.3離心條件下的上清液重復處理在粗多糖液中加入1/5體積的Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4:1),劇烈振蕩30min,3000r/min離心20min取上清液,除去水與有機相間的變性蛋白層,上清液再按上述步驟重復處理5次,至氯仿與水層之間無白色膠狀物產生。最后得到脫蛋白的薏苡仁多糖液,減壓濃縮至一定體積,加入4倍體積95%乙醇醇沉,靜置澄清后傾去上清液,然后再加少量蒸餾水溶解,再醇沉,如此重復3次,以除去Sevag試劑。1.4.4脫衣舞脫蛋白后的薏苡仁多糖水溶液以濃氨水(或NaOH溶液)調至pH8.0,滴加30%H2O2至淺黃色,于50℃水浴保溫2h。1.4.5分離膜的制備用截留相對分子質量為7000~14000的透析袋,流水透析2d,再以蒸餾水透析1d。單糖、雙糖及無機鹽等小分子物質可以透出膜外,而所要的薏苡仁多糖被截留在膜內,從而達到對多糖純化的目的。將多糖溶液濃縮,并定容至25mL備用。1.4.6洗脫曲線檢測DEAE-52纖維素粉→充分溶漲→漂洗3次→1mol/LNaOH溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→1mol/LHCl溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→1mol/LNaOH溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→裝柱→平衡→加樣1mL→以蒸餾水洗脫(5mL/管,收集30管)→苯酚-硫酸法檢測得洗脫曲線1.4.7洗脫曲線的測定SephadexG-75粉→充分溶漲→漂洗3次→1mol/LNaOH溶液浸泡1h→蒸餾水洗至中性→裝柱→平衡→加樣1mL→分別以蒸餾水、0.1mol/LNaCl溶液、0.3mol/LNaCl溶液為洗脫液洗脫(5mL/管,收集30管)→苯酚-硫酸法檢測,得到三條洗脫曲線→分別合并高峰部分備用1.5紫外分光光度法的純度分別取5mL上述純化后的薏苡仁多糖溶液,于200~400nm區(qū)間進行紫外光譜掃描,觀察在260、280nm處是否有吸收。2結果與分析2.1特性與多糖含量的關系經實驗得標準曲線方程為Y=0.0177X-0.0151(相關系數R2=0.9993)?；貧w分析表明,在10~50μg/mL范圍內葡萄糖的質量與吸光度呈良好線性關系。將薏苡仁粗多糖樣品溶解到水中,稀釋至合適濃度,按此方法測定多糖含量。實驗測得換算因子f=0.1236。2.2提取溫度及時間如表2所示,試驗中各影響因素的主次順序如下:B(提取溫度)>C(料液比)>A(提取時間)。正交試驗所得最佳工藝為A3B3C1,按此工藝提取薏苡仁多糖,多糖得率為5.53%(n=3)。2.3杏仁糖的分離和提取2.3.1層析洗脫曲線以蒸餾水為洗脫液,得薏苡仁多糖的DEAE-52柱層析洗脫曲線,如圖1所示,只有一個單一的主峰。經DEAE-52柱層析,既可以進一步除去色素,又能除去其他雜質,干燥得到的薏苡仁多糖為白色固體。2.3.2洗脫溶劑的選擇薏苡仁多糖的SephadexG-75凝膠柱層析特性的考察,分別以蒸餾水、0.1mol/LNaCl溶液、0.3mol/LNaCl溶液為洗脫液洗脫(5mL/管,收集30管),苯酚-硫酸法檢測,得到以上3條洗脫曲線,結果如圖2所示。3個峰形圖大致相同,以0.1mol/LNaCl溶液作為洗脫液的洗脫效果最佳。該洗脫曲線型特征為薏苡仁多糖研究提供了初步質量指標之一。2.4成品的譜掃描結果由不同洗脫液得到的薏苡仁多糖的紫外光譜掃描結果(圖3)可以看出,在260nm和280nm處均無吸收峰,證明純化后的薏苡仁多糖中不含核酸和蛋白質。3結論1.3.3.超聲溫度和提取時間對多糖得率的影響3.1薏苡仁多糖提取工藝優(yōu)化結果表明,其最佳工藝條件為料液比1:15、提取溫度100℃、提取時間150min。提取溫度是影響多糖得率的最主要因素,薏苡仁多糖主要存在于胚乳細胞的細胞壁中,在一定的溫度范圍內,較高的提取溫度利于胚乳細胞壁破碎而使多糖溶出。隨著溫度的提高,多糖得率也逐漸增加,溫度100℃時多糖得率最高。料液比影響次之,提取時間在3個因素中對多糖得率影響最小,故在工業(yè)化生產中,考慮成本及工序問題,可適當縮短提取時間。在最佳條件下多糖得率為5.53%,與以往的報道相比條件適宜且多糖的得率有所提高。3