中藥微生物發(fā)酵技術(shù)的研究進展

中藥微生物發(fā)酵技術(shù)的研究進展

液體發(fā)酵法是將營養(yǎng)物質(zhì)溶解在液體中作為培養(yǎng)基，然后連接到細(xì)菌，并通過一段時間培養(yǎng)目標(biāo)。液體發(fā)酵的優(yōu)點是規(guī)模大,可以進行工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn),產(chǎn)量高,生產(chǎn)效率高,適于機械化和自動化生產(chǎn),是當(dāng)前微生物發(fā)酵工業(yè)的主要生產(chǎn)方式。實驗室中的液體發(fā)酵可以使微生物迅速生長、繁殖,獲得大量的培養(yǎng)物。液體發(fā)酵有靜置培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)兩種類型,靜置培養(yǎng)適于厭氧菌發(fā)酵,如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等發(fā)酵;通氣發(fā)酵適于好氧菌發(fā)酵,如抗生素、氨基酸、核苷酸等發(fā)酵。液體發(fā)酵受物質(zhì)濃度、接種量、培養(yǎng)基成分、溫度、pH、需氧量、發(fā)酵時間等條件制約。二戰(zhàn)時期,由于成功創(chuàng)立了液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù),特別是通氣攪拌液體發(fā)酵技術(shù),使青霉素作為醫(yī)治戰(zhàn)傷感染的藥物而迅速工業(yè)化生產(chǎn),加之微生物代謝調(diào)控技術(shù)的應(yīng)用和微生物發(fā)酵原料由過去單一性碳水化合物向非碳水化合物的變化,使發(fā)酵技術(shù)得以廣泛地應(yīng)用到工業(yè)、食品、藥品等各個方面。液體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于中藥研究開始于20世紀(jì)80年代,是將中藥材與輔料拌和,置于一定溫度和濕度下,通過微生物的發(fā)酵達(dá)到提高中藥藥效、改變藥性、降低毒副作用、擴大用藥品種等目的。國內(nèi)外學(xué)者相繼開展了利用微生物分解轉(zhuǎn)化中藥,特別依靠微生物對中藥與中藥藥渣進行轉(zhuǎn)化和再利用,對冬蟲夏草、銀杏、紅豆杉等多種名貴中藥進行了大規(guī)模的發(fā)酵實驗,并對發(fā)酵后產(chǎn)物的化學(xué)成分及藥理活性進行了較深入的研究,取得了有意義的研究成果。隨著微生物研究的深入以及分離技術(shù)和結(jié)構(gòu)鑒定的不斷發(fā)展,研究發(fā)現(xiàn)真菌的液體發(fā)酵技術(shù)簡易可行,通過對中藥進行液體培養(yǎng),除能夠大量增殖菌絲或孢子,還可在發(fā)酵液中得到多糖、多肽、生物堿、萜類化合物、甾醇、酶、核酸、氨基酸、維生素、植物激素等多種具有生理活性的物質(zhì),這些物質(zhì)具有抗癌、抗炎、抗菌、抗?jié)兒涂顾ダ系裙π?。我國藥用真菌的液體發(fā)酵技術(shù)已接近世界先進水平,藥用真菌的生產(chǎn)也由田間栽培發(fā)展到工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn),這種方法周期短、規(guī)模大、效率高、質(zhì)量穩(wěn)定,且可直接從發(fā)酵液中分離提取活性成分。藥用真菌的液體發(fā)酵技術(shù)已成為中藥研發(fā)的一個重要方向,液體發(fā)酵技術(shù)在中藥的研究與開發(fā)中主要有以下幾方面的特點。1小堿的發(fā)酵轉(zhuǎn)化中藥中含有的化學(xué)活性成分有揮發(fā)油、生物堿、皂苷類、蒽醌類、萜類、黃酮類等,提高中藥有效成分的含量,使中藥能最大限度地發(fā)揮作用,是中藥現(xiàn)代提取研究的一個重要方面。徐非一等采用微生物發(fā)酵法,從中藥牛蒡子中篩選到一株具有轉(zhuǎn)化牛蒡子苷能力的菌株HB-2,將其用于牛蒡子發(fā)酵時,利用其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶將牛蒡子苷轉(zhuǎn)化為牛蒡子苷元,將天然牛蒡子中含量甚微的有效成分牛蒡子苷元含量提高數(shù)十倍,提高了牛蒡子的利用率。歐志敏等采用黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶酶液直接水解牛蒡子苷制備牛蒡子苷元,產(chǎn)率可以達(dá)到94.7%。甘草次酸是甘草中重要有效成分之一,但其含量較低。陳永強通過高產(chǎn)β-葡萄糖醛酸酶的菌種HC-12對甘草酸進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化,在優(yōu)化的發(fā)酵和酶解條件下,使甘草酸在較短的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化為甘草次酸和兩分子13-D-葡萄糖醛酸,避免了酸水解法成分易破壞的不足,顯著提高了中藥甘草的有效成分含量。殷紅等對產(chǎn)生小檗堿產(chǎn)量比出發(fā)菌株有明顯提高的高產(chǎn)菌株S-NU-3-2的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,為開發(fā)利用發(fā)酵方法生產(chǎn)小檗堿的新途徑奠定了基礎(chǔ)。敢小雙用真菌糙皮側(cè)耳對中藥黨參進行液體發(fā)酵處理,發(fā)現(xiàn)黨參皂苷、黃酮含量增加。王建玲等利用新月彎孢霉對重樓的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)重樓皂苷的轉(zhuǎn)化得到了明顯的提高,轉(zhuǎn)化率達(dá)76.80%。田天麗從自然長菌的虎杖上分離鑒定了一株能轉(zhuǎn)化兩種苷類成分的根霉T-34,可高效、專一地將虎杖苷轉(zhuǎn)化成更有效的成分白藜蘆醇,將大黃素8-0-β-D-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化成大黃素,白藜蘆醇和大黃素的提取率分別達(dá)到54%和80%。余志堅等研究發(fā)現(xiàn)用銀杏水提取液對靈芝進行液體發(fā)酵,可促使其主要成分———三萜含量增加17.1%。Liulin等使用木霉菌液體發(fā)酵山藥,研究出了由石油醚、乙醇和硫酸銨組成的三液相的最佳組合方式,最大限度地分離出山藥中皂苷元(回收率達(dá)97.24%)和甾體皂苷(回收率幾乎達(dá)100%)。張曉潔等首次從重樓組織中分離出若干株內(nèi)生菌經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生重樓的主要成分———甾體皂苷,有望緩解重樓藥用資源的緊缺。李姝諾等首次篩選出產(chǎn)黃酮類化合物的越橘內(nèi)生真菌,檢測出該菌株所產(chǎn)生的黃酮類化合物與越橘原植物產(chǎn)生的黃酮類化合物相同或相似,為將來利用工業(yè)發(fā)酵方法大量生產(chǎn)藥用黃酮類物質(zhì)提供了依據(jù),對開發(fā)利用越橘資源有重要意義。2對活性成分的檢測在液體發(fā)酵時,中藥中的活性成分可能被微生物轉(zhuǎn)化或修飾,產(chǎn)生新的物質(zhì),為研發(fā)新藥提供了一條可能的途徑。徐春等用地衣芽孢桿菌發(fā)酵紅花黃色素A,高效液相檢測發(fā)酵后生成了一種新的物質(zhì),對其分離、純化,通過紫外光譜、紅外光譜和質(zhì)譜等方法確定了其結(jié)構(gòu)式,同時藥效學(xué)實驗證明該新物質(zhì)抗血栓作用強于紅花黃色素A或纖溶酶。王曦等研究用乳酸菌發(fā)酵的黃芪發(fā)酵液抗疲勞實驗中發(fā)現(xiàn)該發(fā)酵液能顯著延長小鼠負(fù)重游泳時間,而相同劑量下黃芪不具有該作用。崔月花等發(fā)現(xiàn)薏苡仁對靈芝菌絲生長和靈芝發(fā)酵產(chǎn)物清除自由基有促進作用,并進行高效液相色譜分析,發(fā)現(xiàn)添加薏苡仁的靈芝發(fā)酵產(chǎn)物中出現(xiàn)了新的活性成分,具體是何物質(zhì)有待驗證。此外,LiuDerzen等對珍貴稀有的臺灣牛樟芝分別進行野生體、固體和液體發(fā)酵,研究其對小膠質(zhì)細(xì)胞的抗炎效果和防止神經(jīng)退行性疾病的作用機制研究。3中藥和生物活性化合物由于有些中藥不僅可以為發(fā)酵物質(zhì)提供營養(yǎng)成分,還能促進其活性物質(zhì)的生產(chǎn),所以不少學(xué)者通過中藥材作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分,來增強藥效和使其配伍產(chǎn)生協(xié)同作用。陳麗華等在黑木耳的液體培養(yǎng)基中通過添加中藥來增強黑木耳的降脂作用,研究結(jié)果表明添加何首烏、銀杏葉和決明子能提高黑木耳的降脂功效。李津等利用啤酒酵母提取出具有生物活性的GTF(葡萄糖耐量因子)。劉亞明等將GTF與中藥葛根的有效物質(zhì)葛根素共同發(fā)酵后,發(fā)現(xiàn)葛根素有穩(wěn)定GTF活性和調(diào)控胰島素受體基因的作用。張東升等以靈芝作為出發(fā)菌株,以中藥葛根作為液體深層發(fā)酵基質(zhì)時,發(fā)現(xiàn)葛根對靈芝菌絲體的生長具有促進作用,并對超氧陰離子的清除能力比靈芝效果好。崔月花等把7種中藥作為基質(zhì)發(fā)酵靈芝后,添加銀杏葉、薏苡仁、生姜后靈芝清除羥自由基和超氧陰離子的效果都有提高,薏苡仁效果最好。陳俊榮等研究發(fā)現(xiàn)黃芪發(fā)酵粉(中藥黃芪經(jīng)液體深層發(fā)酵后低溫干燥并進行破壁處理而制得的棕色粉末)對腫瘤化療藥物環(huán)磷酰胺有顯著增效和減毒作用。賀晨雨發(fā)現(xiàn)黃芪粉有調(diào)節(jié)脂代謝、降低血糖的生物學(xué)效應(yīng)。王鋒等研制出苦瓜雞腿蘑發(fā)酵液α-葡萄糖苷酶及非酶糖基化的抑制率明顯強于其他中藥,且隨著發(fā)酵液劑量加大降糖作用明顯增強,優(yōu)于未添加苦瓜組和陽性對照組。4液體發(fā)酵工藝菌科中藥以固體栽培發(fā)酵為主,液體發(fā)酵技術(shù)可影響菌科生物量、多糖等。李羿等研究表明茯苓發(fā)酵罐液體補料發(fā)酵與搖瓶補料液體發(fā)酵相比,可提高茯苓的生物量,使菌絲干重從10.74g/L增長到11.95g/L;將薏苡仁添加到茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,可促進茯苓的生長;在最佳補料液體發(fā)酵工藝條件下,茯苓菌絲體產(chǎn)量達(dá)15.09g/L,茯苓胞外多糖產(chǎn)量達(dá)7.52g/L;將薏苡仁、黃芪、金銀花、甘草等9味中藥固體粉末添加到發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,研究表明其對茯苓搖瓶液體發(fā)酵中菌絲體和胞外多糖產(chǎn)量有影響。吳紅娟等發(fā)現(xiàn)加松根液發(fā)酵培養(yǎng)的茯苓菌絲產(chǎn)量提高,但水溶性多糖含量下降;發(fā)酵菌絲中水溶性多糖含量較天然茯苓顯著提高。張帆等以菌絲體的生物量和多糖為指標(biāo),對中藥大馬勃的液體發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化篩選,確定了最佳液體培養(yǎng)基組成,為液體發(fā)酵生產(chǎn)大馬勃的工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。劉媛等研究了10種具有消炎功效的中藥對靈芝菌液體培養(yǎng)的影響,觀察中藥對靈芝菌生長和代謝產(chǎn)物靈芝酸的影響,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可明顯改變靈芝生物量和胞外靈芝酸產(chǎn)量的作用。楊海龍等研究了薏苡仁為基質(zhì)的靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基的條件,薏苡仁油作為基質(zhì)時,發(fā)現(xiàn)該成分能促進靈芝菌解體及胞外多糖的生產(chǎn)。畢澎洋等直接在培養(yǎng)基中加入不同濃度的薏苡仁油和薏苡仁酯,可促進靈芝菌體生長、靈芝多糖及靈芝酸的生產(chǎn)。朱強等以固定量的甘草、山茱萸、黃芪、黃芩4種中藥作為培養(yǎng)基進行靈芝的液體發(fā)酵時,發(fā)現(xiàn)甘草和山茱萸對靈芝的生長有明顯的促進作用,甘草利于促進靈芝酸,尤其是胞外靈芝酸的合成,山茱萸利于促進靈芝多糖,尤其是胞外靈芝多糖的合成。汪維云等以菌絲生物量為響應(yīng)值的響應(yīng)面方程,對灰樹花液體發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化;應(yīng)用徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法,對菌絲生物量進行了擬合;采用正交試驗方法,研究了醇析濃度、浸提次數(shù)、浸提溫度等因子對多糖提取量的影響。周洪波等以菌絲體質(zhì)量濃度(干重)和發(fā)酵液中甘露醇濃度為指標(biāo),研究了蛹蟲草液體培養(yǎng)中物理影響和培養(yǎng)基的最優(yōu)控制,還創(chuàng)新性地采用了pH分段控制發(fā)酵策略以利于蟲草生長,菌絲體質(zhì)量濃度為17.31g/L,甘露醇質(zhì)量濃度達(dá)43.47g/L。5中藥藥渣的發(fā)酵中藥廢渣含有大量粗纖維、木質(zhì)等難以分解的材料,還含有一些中藥有效活性成分和粗蛋白、粗脂肪、礦物質(zhì)等營養(yǎng)素,采用液體發(fā)酵技術(shù)可實現(xiàn)對中藥廢渣再利用,減少藥渣對環(huán)境的污染,提高對中藥的利用率。焦巧芳通過發(fā)酵黃芪藥渣篩選出可以作為中藥藥渣微生物轉(zhuǎn)化利用的功能菌———棘孢木霉,并檢測了酶活性、黃芪甲苷的含量、纖維素含量、抑菌性等,得到了該菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化條件。王建芳等采用香菇作為出發(fā)菌種對鼻淵舒系列產(chǎn)品的中藥廢渣進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化,在最優(yōu)發(fā)酵條件下產(chǎn)物中粗蛋白和多糖的含量分別達(dá)19.84%和33.37%,經(jīng)過液體發(fā)酵鼻淵舒中藥廢渣粗蛋白和可溶性多糖含量明顯提高,纖維素含量降低。中藥廢渣發(fā)酵物能促進小鼠體重增加,增加免疫器官的發(fā)育,提高免疫能力,可作為一種增強免疫作用的飼料添加劑。6味地黃湯中藥生物制劑中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的主要方式,是由飲片組成并與“證”相關(guān)的治療系統(tǒng),中藥復(fù)方經(jīng)液體發(fā)酵后能顯著提高療效,具有減毒增效的作用。趙越將一種含有豐富的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)的古老菌體———光合細(xì)菌引入到六味地黃湯中進行發(fā)酵代謝,通過光合細(xì)菌的生物轉(zhuǎn)化功能和自身營養(yǎng)價值的利用,制備出了六味地黃湯中藥生物制劑,該制劑經(jīng)微生物發(fā)酵處理,將大分子物質(zhì)代謝為小分子活性物質(zhì),提高了生物利用度,吸收迅速、完全,并降低了服用量,在增強免疫、抗衰老和治療腎陰虛等方面具有明顯作用,優(yōu)于傳統(tǒng)的六味地黃湯。郭芳等研究了六味地黃發(fā)酵液的免疫調(diào)節(jié)作用、抗瘤和減毒作用,表明六味地黃發(fā)酵液在增強小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能上優(yōu)于六味地黃煎劑,非特異性免疫功能與傳統(tǒng)煎劑比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;六味地黃發(fā)酵液對小鼠肝癌H22腫瘤生長具有顯著的抑制作用,而六味地黃煎劑無此作用,并能升高外周血白細(xì)胞,表明六味地黃發(fā)酵液可抗腫瘤,并能減低化療所致造血系統(tǒng)毒性損傷。徐啟華等對玉屏風(fēng)散發(fā)酵液與玉屏風(fēng)散煎劑的免疫作用做了對比研究,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液能增強小鼠免疫功能,效果好于傳統(tǒng)煎劑。7乳酸發(fā)酵飲料有些中藥為藥食共有資源,液體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于這類資源,可制得集營養(yǎng)與保健功能于一體的新型食品。葛根為我國衛(wèi)生部公布的藥食共有資源,以葛根為原料,張麗杰等采用雙酶法生產(chǎn)酒精度為6.4%vol,總黃酮量為28.66mg/mL的葛根功能保健酒。張雁等將葛根汁與鮮牛奶按3:7進行配比,經(jīng)乳酸發(fā)酵后制備出一種具有葛根和酸奶雙重營養(yǎng)保健作用的無糖葛根酸奶制品。三株口服液以黑大豆發(fā)芽后的水提取液為發(fā)酵藥材,以人體胃腸道中的雙歧桿菌、乳桿菌和腸球菌為發(fā)酵菌種,在發(fā)酵罐內(nèi)經(jīng)液體混合發(fā)酵而成,臨證對便秘、脾虛證、淺表性胃炎及慢性非特異性結(jié)腸炎有良好治療作用。綜上所述,液體發(fā)酵技術(shù)在中藥的研究