高效液相色譜法測(cè)定薏苡仁中的甘油

高效液相色譜法測(cè)定薏苡仁中的甘油

愛(ài)斯隆又名巴谷、甘草、菩提珍珠、溝渠、胡蘿卜和椰子。它是水稻科的一種干燥、成熟的植物。它有很甜，有點(diǎn)冷。具有利尿消腫、健脾除濕、舒筋除濕、清熱祛膿等功效。這是常用的利水抗?jié)袼帯，F(xiàn)代研究表明,薏苡仁中的薏苡仁油具有抗腫瘤的作用,其抗腫瘤的活性成分為甘油三酯類(lèi)組分,其中有甘油三油酸酯,甘油三亞油酸酯,1,2-油酸-3-亞油酸-甘油三酯,1,2-亞油酸-3-油酸-甘油三酯等,對(duì)于薏苡仁油中活性成分含量的測(cè)定,現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,高效液相色譜法測(cè)定薏苡仁中甘油三油酸酯的含量,柱前衍生HPLC法測(cè)定薏苡仁油中的脂肪酸含量,這兩種方法雖然具有靈敏度和準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn),但存在測(cè)試周期較長(zhǎng)、操作成本較高和前處理過(guò)程繁雜等缺點(diǎn),另由于甘油三酯中脂肪酸種類(lèi)的多樣,選擇內(nèi)標(biāo)物較困難而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文采用紫外-可見(jiàn)光譜法通過(guò)對(duì)甘油三酯中甘油的定量測(cè)定間接得到甘油三酯的含量,因此一對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系準(zhǔn)確,克服了選擇內(nèi)標(biāo)物困難的缺點(diǎn)。本方法樣品制備方法和處理過(guò)程簡(jiǎn)便,測(cè)試儀器為常規(guī)試驗(yàn)分析儀器,成本低廉,具有測(cè)定結(jié)果快速、準(zhǔn)確性較高,精密度滿足要求,避免了色譜技術(shù)的缺點(diǎn),適用于實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中定量監(jiān)測(cè)薏苡仁油中甘油三酯含量的變化。1儀器和試劑1.1清洗器er-u-1T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司);KQ5200超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司59KHz);ER-180A分析天平(A&DCompanyLimited);RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。1.2薏養(yǎng)殖油巖石型甘油三油酸酯對(duì)照品(Sigma公司,批號(hào)067K1833,純度≥99%);薏苡仁油:購(gòu)于廣州合誠(chéng)三先生物有限公司;乙酸、高碘酸鈉、乙酰丙酮、異丙醇、乙酸銨、氯化鉀、氫氧化鉀、石油醚等均為分析純。2方法2.1液氧化法制備出甘油和脂肪酸通過(guò)對(duì)甘油三酯中甘油的定量測(cè)定來(lái)間接得到甘油三酯的含量。利用異丙醇配制一定濃度的甘油三酯溶液,與KOH或NaOH溶液反應(yīng),使甘油三酯水解為甘油和脂肪酸,其中甘油在氯離子的協(xié)同作用下與氧化試劑發(fā)生氧化反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物與顯色試劑發(fā)生顯色反應(yīng),生成黃色的有機(jī)物質(zhì),該物質(zhì)在412nm處有最大光譜特征吸收峰,其顏色的深淺與甘油三酯的含量成正比例關(guān)系。該方法能夠快速、準(zhǔn)確測(cè)定油脂中甘油三酯含量,不僅操作方便,而且測(cè)試成本較低,可用于活性成分甘油三酯含量的快速測(cè)定。2.2樣品儲(chǔ)備溶液的制備精密稱(chēng)取薏苡仁油30.2mg,置于50ml的棕色容量瓶中,加異丙醇定容至刻度,即得0.604mg/ml的樣品儲(chǔ)備液。2.3對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備精密稱(chēng)取甘油三油酸酯對(duì)照品50.5mg,置于25ml的棕色容量瓶中,加入適量異丙醇使其溶解后并定容至刻度,即得2.02mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。2.4紫外-可見(jiàn)光譜掃描分別精密量取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml對(duì)照品儲(chǔ)備液于10ml棕色容量瓶中,加異丙醇至刻度,稀釋成系列濃度為0.202,0.404,0.606,0.808,1.01mg/ml的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。移取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml于棕色反應(yīng)瓶中,依次加入10%KOH溶液1ml,50℃水浴中反應(yīng)15min后,冷卻至室溫,然后加入0.5ml0.1mol/L的協(xié)同氯離子溶液、氧化試劑1ml反應(yīng)10min,反應(yīng)結(jié)束后加入5ml顯色試劑在50℃下反應(yīng)30min,冷卻至室溫。另移取1ml異丙醇于一同樣的棕色反應(yīng)瓶中按同樣的過(guò)程處理作為參比溶液,于350～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描,并在412nm處測(cè)定吸光度,對(duì)標(biāo)樣濃度作工作曲線并檢驗(yàn)其線性關(guān)系。上述步驟中協(xié)同氯離子溶液是KCl溶液;氧化試劑是2mol/L的乙酸溶液和0.05mol/L的高碘酸鈉溶液等體積混合而成;顯色試劑是0.5ml乙酰丙酮、30ml異丙醇、100ml2mol/L的乙酸銨溶液和60ml2mol/L的乙酸溶液相混合而成。2.5紫外-可見(jiàn)光譜掃描取5ml樣品儲(chǔ)備液,加入5ml10%的KOH溶液,50℃水浴中反應(yīng)15min,冷卻至室溫后加入2.5ml0.1mol/L的協(xié)同氯離子溶液、5ml氧化試劑反應(yīng)10min,反應(yīng)結(jié)束后加入25ml顯色試劑在50℃下反應(yīng)30min,冷卻至室溫即為樣品使用液。移取適量樣品使用液,于350～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描,并在412nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)測(cè)定的吸光度利用工作曲線計(jì)算試樣中甘油三酯的含量。測(cè)定時(shí)上述物質(zhì)所使用的用量在相同用量比例下可同時(shí)放大或縮小用量。2.6精密度實(shí)驗(yàn)取適量樣品使用液,在412nm處連續(xù)測(cè)定5次,計(jì)算RSD。2.7穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)取適量樣品使用液,在412nm處每隔30min測(cè)定1次,共6次,計(jì)算RSD。2.8加樣回收率試驗(yàn)和rsd精密吸取已知含量的樣品儲(chǔ)備液3份,依次加入一定量0.606mg/ml的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液,依樣品使用液的配制方法測(cè)定試樣中甘油三酯的含量并計(jì)算其回收率和RSD。3結(jié)果與討論3.1測(cè)定波長(zhǎng)的確定圖1是在不同濃度下甘油三油酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色產(chǎn)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。由圖1可知,甘油三油酸酯的顯色產(chǎn)物在350～500nm范圍內(nèi)有唯一的特征吸收峰出現(xiàn),且最大吸收波長(zhǎng)位于412nm附近。另外,在實(shí)驗(yàn)配制的濃度范圍內(nèi),甘油三油酸酯顯色產(chǎn)物在412nm的吸光度隨濃度變化顯著,且具有規(guī)律性。因此可以在該波長(zhǎng)利用紫外可見(jiàn)光譜法測(cè)定薏苡仁油中甘油三酯的含量。通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜法測(cè)得不同濃度甘油三油酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液顯色產(chǎn)物的吸收值,繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖2所示。據(jù)線性回歸方程顯示,甘油三油酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)濃度在0.202～1.010mg/ml范圍內(nèi)與吸光值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)為0.9966。3.2最大吸收峰的測(cè)定圖3是薏苡仁油經(jīng)顯色反應(yīng)后的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。從圖3中可以發(fā)現(xiàn)薏苡仁油在412nm處具有明顯的最大吸收峰,這即說(shuō)明了在薏苡仁油中含有甘油三酯,同時(shí)也證明本實(shí)驗(yàn)方法的有效性。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)進(jìn)行了未經(jīng)皂化處理的測(cè)試,但發(fā)現(xiàn)在412nm處沒(méi)有吸收峰出現(xiàn),因此可以肯定在薏苡仁油中沒(méi)有游離狀態(tài)的甘油存在,即測(cè)定值完全是薏苡仁油中甘油三酯的含量。3.3測(cè)定和計(jì)算結(jié)果表1是樣品使用液在412nm處連續(xù)測(cè)得5次的結(jié)果。結(jié)果表明吸光度的RSD=0.61%,精密度符合要求;同時(shí)試樣中甘油三酯的含量可達(dá)92.80%。3.4穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2,由表2可以看出樣品液在2.5h內(nèi)穩(wěn)定性良好,說(shuō)明本方法作為定量方法比較可靠。3.5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)回收率實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明平均回收率為101.20%,RSD為1.47%,說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度較高。4薏養(yǎng)殖中的甘油含量利用紫外-可見(jiàn)光譜法測(cè)定薏苡仁油中