生物技術(shù)制藥乙肝疫苗制備

乙肝疫苗的制備1.2.乙型病毒性肝炎乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒〔HBV〕引起的、以肝臟炎性病變?yōu)橹?，并可引起多器官損害的一種疾病。乙肝廣泛流行于世界各國，主要侵犯兒童及青壯年，少數(shù)患者可轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌。因此，它已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性疾病，也是我國當(dāng)前流行最為廣泛、危害性最嚴(yán)重的一種疾病。乙型病毒性肝炎無一定的流行期，一年四季均可發(fā)病，但多屬散發(fā)。近年來乙肝發(fā)病率呈明顯增高的趨勢。乙肝疫苗的應(yīng)用是預(yù)防和控制乙型肝炎的根本措施。3.乙肝疫苗的概念乙肝疫苗是用于預(yù)防乙肝的特殊藥物。疫苗接種后，可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性抗體，這種抗體存在于人的體液之中，乙肝病毒一旦出現(xiàn)，抗體會(huì)立即作用，將其去除，阻止感染，并不會(huì)傷害肝臟，從而使人體具有了預(yù)防乙肝的免疫力，從而到達(dá)預(yù)防乙肝感染的目的。接種乙肝疫苗是預(yù)防乙肝病毒感染的最有效方法。4.乙肝疫苗的開展史乙肝疫苗形成于1986年，為了得到乙肝疫苗，研究人員從研究復(fù)試病毒，到酵母，并研究純化的蛋白質(zhì)序列。并經(jīng)過了大量的誘導(dǎo)免疫反響。1991年，疫苗被應(yīng)用于高危險(xiǎn)人群。主要是一些兒童，因?yàn)閮和母腥韭蕵O高。2005年，美國推行常規(guī)的疫苗注射。給所有未注射過乙肝疫苗的兒童注射。治療性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的機(jī)體中，通過誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答，到達(dá)治療或防止疾病惡化的天然、人工合成或用基因重組技術(shù)表達(dá)的產(chǎn)品或制品5.疫苗的組成疫苗的組成抗原免疫佐劑6.乙肝疫苗的制備目前使用的乙肝疫苗是基因工程疫苗--重組酵母乙肝疫苗和重組CHO乙肝疫苗，其主要成分是乙肝病毒的外表抗原，即一種乙肝病毒外衣殼蛋白，并非完整病毒。這種外表抗原不含有病毒遺傳物質(zhì)，不具備感染性和致病性，但保存了免疫原性，即刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的能力。乙肝外表抗原曾經(jīng)是從乙肝病毒攜帶者的血液，經(jīng)純化滅活等嚴(yán)格工序制備而來，即血源性疫苗，該疫苗由于平安、來源和本錢等原因已被淘汰(如，有引起血源性疾病的嫌疑和浪費(fèi)大量的血〕7.基因工程乙肝疫苗是采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的，即構(gòu)建含有乙肝外表抗原基因的重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染相應(yīng)的宿主細(xì)胞，如酵母、CHO細(xì)胞，生產(chǎn)乙肝外表抗原蛋白。利用重組酵母生產(chǎn)的叫重組酵母乙肝疫苗，利用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的叫重組CHO乙肝疫苗，劑量為每支5微克。它們都可以用于預(yù)防所有亞型的乙肝病毒感，都可以放心選用。乙肝病毒病理切片8.目的基因的別離培養(yǎng)酵母細(xì)胞〔增〕檢測正確表達(dá)目的產(chǎn)物的酵母〔檢〕0.0重組酵母構(gòu)建重組質(zhì)粒的構(gòu)建〔切，接〕導(dǎo)入酵母細(xì)胞〔轉(zhuǎn)〕轉(zhuǎn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入酵母細(xì)胞內(nèi)。增短時(shí)間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，以擴(kuò)DNA重組分子。檢檢遼寧何氏醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系接用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段連接到質(zhì)粒分子上，構(gòu)成DNA重組分子。根據(jù)已經(jīng)測定的編碼乙肝病毒外表抗原決定簇基因序列，用化學(xué)合成法直接合成目的基因。用識(shí)別相同黏性末端的限制性內(nèi)切酶將外源DNA和質(zhì)粒分子切開。切篩選和鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的酵母細(xì)胞，獲得外源基因高效表達(dá)的基因工程菌9.菌種制備和發(fā)酵用成功構(gòu)造的基因工程菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過逐級(jí)放大至發(fā)酵罐。發(fā)酵過程應(yīng)該具有以下特點(diǎn)：原料以碳水化合物為主，不含有毒物質(zhì)，并參加少量有機(jī)和無機(jī)氮源；能容易進(jìn)行大量有效的乙肝病毒外表抗原的生產(chǎn)；生物反響過程是以生命體的自動(dòng)調(diào)節(jié)方式進(jìn)行的，多個(gè)反響像一個(gè)反響一樣，在單一設(shè)備中進(jìn)行；生產(chǎn)過程中，通常常溫進(jìn)行，操作溫和，不考慮防爆問題；能夠高度選擇性的進(jìn)行復(fù)雜化合物在特定局部的反響，如氧化、復(fù)原、官能團(tuán)導(dǎo)入；生產(chǎn)過程中考慮防止雜菌的污染。

發(fā)酵過程中，可采用分批補(bǔ)料或連續(xù)流加補(bǔ)料以保證最優(yōu)生長和維持細(xì)胞濃度、生長速度和營養(yǎng)供給之間的適當(dāng)平衡?？商砑诱T導(dǎo)劑如乳糖到發(fā)酵液中去以誘導(dǎo)可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的表達(dá)。

10.別離純化細(xì)胞破碎微濾超濾微濾超濾硅膠吸附疏水層析硫氰酸鹽處理凝膠層析離子交換層析無菌過濾無菌過濾氫氧化鋁共沉淀11.細(xì)胞破碎

微濾

超濾

發(fā)酵結(jié)束后，通過過濾或離心，使酵母與發(fā)酵液別離，然后細(xì)胞通過高壓勻漿機(jī)破碎，釋放出抗原。酵母的細(xì)胞壁較厚，比大腸桿菌難破碎，可在高壓勻漿機(jī)內(nèi)施加幾千個(gè)大氣壓力，通過針形閥突然降壓到零，使細(xì)胞破碎。在細(xì)胞破碎前參加蛋白酶抑制劑以防抗原被分解。細(xì)胞破碎后參加外表活性劑使抗原溶解。粗細(xì)胞裂解物用0.2um中空纖維柱進(jìn)行微濾?？乖痛缶植康头肿恿克拗骷?xì)胞內(nèi)含物通過濾膜，細(xì)胞碎片被膜攔截。濾液再進(jìn)行超濾，此時(shí)抗原被膜攔截而低分子量宿主細(xì)胞內(nèi)含物通過濾膜除去。12.凝膠層析離子交換層析13.凝膠層析別離原理單個(gè)凝膠珠本身象個(gè)"篩子"。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。如果將這樣的凝膠裝入一個(gè)足夠長的柱子中，作成一個(gè)凝膠柱。當(dāng)含有大小不同的蛋白質(zhì)樣品加到凝膠柱上時(shí)，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質(zhì)就要連續(xù)不斷地穿入珠子的內(nèi)部，這樣的小分子不但其運(yùn)動(dòng)路程長，而且受到來自凝膠珠內(nèi)部的阻力也很大，所以越小的蛋白質(zhì)，把它們從柱子上洗脫下來所花費(fèi)的時(shí)間越長！凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。因此，大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來。凝膠過濾所用的凝膠孔徑大小的選擇主要取決于要純化的蛋白質(zhì)分子量。14.凝膠層析別離原理示意圖遼寧何氏醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系15.凝膠層析離子交換層析16.離子交換層析原理離子交換層析〔IonExchangeChromatography簡稱為IEC〕是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組別離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差異而進(jìn)行別離的一種層析方法。離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陽離子交換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陰離子樹脂。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。17.離子交換層析示意圖遼寧何氏醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系18.

無菌過濾氫氧化鋁共沉淀

分裝純化后的抗原再與氫氧化鋁共沉淀，在共沉淀時(shí)，抗原吸附在氫氧化鋁上。遼寧何氏醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系19.疫苗純度的測定乙肝疫苗是通過肌肉注射的方式進(jìn)入人體系統(tǒng)，為了降低疫苗內(nèi)雜質(zhì)含量對(duì)人體產(chǎn)生的不良影響，必須進(jìn)行疫苗的純度檢測。對(duì)重組酵母乙肝疫苗，現(xiàn)有的HPLC檢測系統(tǒng)應(yīng)用0.1mol/L

DTT〔DTT即DL-Dithiothreitol，中文名為二硫蘇糖醇〕與1:50吐溫80等量混合處理后能有效地檢測不同類型重組乙肝疫苗外表抗原的純度。

DTT結(jié)構(gòu)式20.疫苗的