鼻咽癌細胞中pk3kak和erkmapk信號傳導通路異常激活的研究

鼻咽癌細胞中pk3kak和erkmapk信號傳導通路異常激活的研究

胰島素樣生長因子-1的受體（igf-1r）與異體igf-1的結(jié)合，激活了pi3k-akt和erk-mek兩個信號傳導通道，在腫瘤細胞的克隆、分化和細胞分化方面發(fā)揮著重要作用。本研究采用蛋白印跡技術(shù)研究低分化鼻咽癌細胞中IGF-1R及其下游的2個重要分子AKT和ERK的活性表達水平,以及分別給予信號傳導通路抑制劑Wortmannin或PD98059后,對鼻咽癌細胞株CNE2中AKT和ERK磷酸化的調(diào)節(jié)作用,探討IGF-1R、PI3K/AKT和ERK/MAPK信號傳導通路異常激活在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。1材料和方法1.1運動組織的凍存武漢大學中南醫(yī)院耳鼻咽喉科2005-03收治3例鼻咽癌患者,均為男性,年齡分別為45、56和58歲,并經(jīng)3名資深病理學專家閱片并確診病理類型為低分化鱗狀細胞癌,鼻內(nèi)窺鏡下取癌組織及其周圍鼻咽慢性炎癥黏膜組織,立即凍存于液氮中。實驗時切取液氮保存的鼻咽癌配對標本各100mg,迅速研磨粉碎,然后加300～500μL細胞裂解液(PBS-TDS內(nèi)加有蛋白酶和磷酸化酶抑制劑)裂解細胞,6000r/min離心10min(R=15cm,4℃),取上清液測蛋白濃度,然后采用蛋白質(zhì)印跡法測定鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織和鼻咽慢性炎癥黏膜組織中IGF-1R、AKT和ERK1/2蛋白表達水平,β-actin為LoadingControl,實驗至少重復4次。1.2材料h0粒體人鼻咽癌細胞株CNE2(來源于人類低分化鼻咽鱗狀細胞癌)由瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學院MTC胡立夫教授友好贈送。IGF-1Rβ亞基(H60)粒體為SuntaCruz公司產(chǎn)品。pERK1/2單克隆抗體、pAKT(Ser473)多克隆抗體和選擇性抑制ERK/MAPK的抑制劑PD98059均購于CellSignaling公司,IGF-1購自晶美生物工程公司,蛋白激酶抑制劑Wortmannin購自Sigma公司,IMDM培養(yǎng)液為Gibcol公司產(chǎn)品,蛋白質(zhì)印跡法儀器為美國Bio-Bad公司產(chǎn)品。1.3imda的檢測人鼻咽癌細胞株CNE2等量置于6孔盤中,用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液在37℃,體積分數(shù)為95%空氣或5%的CO2培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。待細胞處于對數(shù)生長期時更換無血清的IMDM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h后將其分成3組:第1組為未加任何處理組(對照組);第2組為收獲細胞前10min僅給予IGF-1;第3組為培養(yǎng)24h后分別給予PD98059(50μmol/L)或Wortmannin(100nmol/L)作用1h,然后收獲細胞前10min給予IGF-1(10μg/L)刺激,4℃下立即收獲細胞,并提取蛋白。1.4westernblot,wb-brin-al4e,nd-pb-pak/erk蛋白表達上述不同處理組的細胞系分別培養(yǎng)于6孔盤內(nèi),收獲細胞前用4℃PBS洗3次,然后加300～500μL細胞裂解液(PBS-TDS內(nèi)加有蛋白酶和磷酸化酶抑制劑)裂解細胞,6000r/min離心10min(R=15cm,4℃),取上清液,BCA法測蛋白濃度,并調(diào)整各樣本濃度一致。取50μL樣本置500μLEP管內(nèi)并加等量LoadingBuffer,在95℃水浴槽中加熱10min,然后蛋白樣品進行SDS(7.5%)電泳,并轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上,用一抗稀釋液(1∶1000)孵育1h,PBS洗,然后用二抗稀釋液(1∶1000)孵育1h,PBS洗,接著用streptavidin-labeledhorseperoxidase稀釋液(1∶1000)孵育45min,Hyperfilm-ECL顯色5min,壓片。磷酸化蛋白pAKT和pERK用抗體Ser-473和抗磷酸化ERK去免疫印跡,總的AKT和ERK蛋白作為LoadingControl。膠片用Fluor-S(BioRad)掃描并用相關(guān)軟件進行分析。本實驗至少重復3次且得到類似結(jié)果。1.5elisa法檢測細胞生長采用細胞增殖盒kitⅡ(Roche公司產(chǎn)品),四唑氮衍生物可作為線粒體脫氫酶的作用底物,被活細胞還原成水溶性的棕黃色甲簪產(chǎn)物(formazan)。代謝產(chǎn)物在OD450處有吸收峰,以波長492nm在Elisa上檢測吸光度,繪出細胞生長曲線,具體實驗過程為:細胞置于滅菌加100μL培養(yǎng)液的96孔盤中培養(yǎng)生長良好,然后加不同濃度Wortmannin(0、10、50、100和200nmol/L)或PD98059(0、5、25、50和100μmol/L)培養(yǎng)24和48h,檢測前4h每孔加XTT試劑50μL混勻再一起培養(yǎng),然后在Elisa上讀取吸光度值,繪出細胞生長曲線,分析癌細胞生長抑制情況,實驗至少重復4次。2結(jié)果2.1igf-1r、erk1/2蛋白表達3例鼻咽低分化鱗癌和CNE2細胞株中IGF-1R、AKT和ERK1/2蛋白均呈高信號表達,而鼻咽炎性組織均為低信號表達,CNE2細胞株中IGF-1R、AKT蛋白信號表達較鼻咽低分化鱗癌稍弱,而ERK1/2蛋白表達稍強;在鼻咽低分化鱗癌和CNE2細胞株中,IGF-1R蛋白表達的平均光密度強度分別是鼻咽炎性組織的25和18倍;AKT蛋白表達的平均強度分別是鼻咽組織的25.6和23.4倍;而ERK1/2蛋白表達的平均強度分別是鼻咽組織的34.6和35.5倍(圖1)。β-actin作為內(nèi)對照組。2.2t、akt蛋白表達水平IGF-1可刺激鼻咽癌細胞的pAKT表達增加,與對照組相比,CNE2細胞中pAKT的表達水平明顯增高,約為對照組的7倍,而非磷酸化的AKT蛋白表達水平無明顯改變。PI3K/AKT信號傳導通路的特異性抑制劑Wortmannin(100nmol/L)可大部分下調(diào)pAKT蛋白的表達水平,但總的AKT表達水平不受影響(圖2)。2.3p-erk抑制劑IGF-1可刺激鼻咽癌細胞的pERK表達增加,與對照組相比,CNE2細胞中p-ERK表達增加2.9倍,PD98059(50μmol/L)可明顯抑制IGF-1激活鼻咽癌細胞pERK活性的上調(diào)。但總的ERK/MAPK蛋白表達不受影響(圖3)。2.4小鼠細胞毒性變化隨著Wortmannin濃度增加(0、10、50、100和200nmol/L),24和48h治療后2條生長曲線逐漸下降,細胞生長明顯抑制,以48h最明顯,其IC50值24h后≤100nmol/L,48h后≤50nmol/L;隨著PD98059濃度增加(0、5、25、50和100μmol/L),24和48h治療后2條生長曲線也明顯下降,細胞生長明顯抑制,以48h最明顯,其IC50值24和48h后均≤50μmol/L(圖4)。3igf-1r、erk、mapk蛋白的表達PI3K/AKT通路在抗凋亡機制中發(fā)揮著重要的作用,同時也啟動一系列與細胞周期調(diào)控、端粒酶活性、血管生成和細胞侵襲遷移相關(guān)的生物學程序。本研究結(jié)果顯示,鼻咽癌組織和細胞株中AKT蛋白的表達水平高于慢性炎性組織;AKT的高表達伴有IGF-1R的過度表達,提示AKT的高表達在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本實驗還發(fā)現(xiàn),IGF-1可刺激鼻咽癌細胞的pAKT表達增加,而非磷酸化的AKT蛋白表達水平無明顯改變。PI3K/AKT信號傳導通路的特異性抑制劑Wortmannin(100nmol/L)可明顯下調(diào)pAKT蛋白的表達水平,但總的AKT表達水平不受影響,提示磷酸化的AKT異常激活和表達升高與鼻咽癌細胞的浸潤性生長有關(guān),而并非總的AKT蛋白的表達增加。有研究表明,MAPK信號傳導通路是細胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,IGF-1R所激活的MAPK信號傳導通路與細胞的生長和增殖密切相關(guān)。也有研究表明,ERK通路是哺乳動物中研究得最早、最深入,也是最重要的一條通路,在許多腫瘤組織中如肺癌、前列腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤都有pERK/ERK的高表達。本實驗研究表明,鼻咽癌組織中ERK1/2蛋白的表達水平高于鼻咽炎性組織,ERK1/2的高表達也伴有IGF-1R的過度表達;pERK在鼻咽癌細胞中均可被IGF-1所激活。PD98059能部分阻滯pERK的激活,而總的ERK蛋白的表達無顯著差異,而且不受PD98059的抑制,提示磷酸化的ERK異常激活和表達升高與鼻咽癌細胞的發(fā)生和生長增殖有關(guān),而并非總的ERK/MAPK蛋白的表達增加。多項研究表明,IGF-1R及其下游2個主要信號傳導通路PKB/AKT和ERK/MAPK是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因素,因此IGF-1R、PKB/AKT和ERK/MAPK可能成為非常有前途的抗癌治療的重要靶物。在本研究結(jié)果中,低分化鼻咽鱗癌組織和細胞株中IGF-1R蛋白過度表達并伴有下游分子AKT、ERK蛋白的明顯上調(diào),IGF-1作用下pAKT和pERK磷酸化水平明顯升高,AKT的抑制劑Wortmannin和ERK的抑制劑PD98059分別能有效地降低pAKT