疏水稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米納米復(fù)合材料的制備與應(yīng)用

疏水稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米納米復(fù)合材料的制備與應(yīng)用

長壽的發(fā)展與新技術(shù)、新方法的應(yīng)用密切相關(guān)。目前人們對于細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)分析和檢測以及疾病早期診斷有著濃厚的興趣,許多研究人員一直致力于新分析技術(shù)的研究和開發(fā)。熒光標(biāo)記作為一種非放射性的生物標(biāo)記技術(shù)受到廣泛重視,并取得迅速發(fā)展。目前用作發(fā)光標(biāo)記物主要有3類材料:有機(jī)熒光材料、半導(dǎo)體量子點(diǎn)及稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料(UCNPs)。其中,UCNPs是一種通過鑭系摻雜將近紅外光轉(zhuǎn)化成可見光的發(fā)光納米材料。相對于有機(jī)染料和量子點(diǎn)而言,UCNPs作為新一代生物發(fā)光標(biāo)記擁有許多優(yōu)點(diǎn),例如毒性小、化學(xué)穩(wěn)定性高、光穩(wěn)定性好、吸收和發(fā)射帶很窄、壽命長。另外近紅外激光作為其激發(fā)源也帶來了許多優(yōu)勢,例如較深的光穿透深度、對生物組織幾乎無損傷、生物組織不會發(fā)光(無背景熒光)等;這些特征導(dǎo)致它們擁有廣闊的、光明的生物應(yīng)用前景。UCNPs用于生物發(fā)光標(biāo)記的前提是:(1)其尺寸較小并形貌可控;(2)發(fā)光效率較高;(3)表面有活性基團(tuán)(如—COOH、—NH2或者—SH),具有水溶性。然而,盡管UCNPs的制備己有多年的研究歷史,并取得了一些重要的研究成果;但是相對于有機(jī)染料和量子點(diǎn)而言,它們在生物標(biāo)記方面的應(yīng)用研究還是較少的,目前還處于研究的初步階段。本文介紹了UCNPs的制備方法、表面修飾及其生物應(yīng)用的最新進(jìn)展。1擴(kuò)展合成ucnps稀土發(fā)光納米材料的制備方法很多,目前共沉淀法、水熱法、溶膠-凝膠法、微乳液法、燃燒法、噴霧熱解法、氣相沉積法等均被用于該類材料的制備。只要合理調(diào)控?fù)诫s離子,這些合成手段都可擴(kuò)展到制備UCNPs。然而,為了滿足尺寸和形貌可控以及上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率高的要求,目前發(fā)展了一些有效的方法來制備UCNPs,主要有油酸或者亞油酸協(xié)助的水熱合成法、三氟乙酸稀土鹽熱分解法、液相共沉淀法。1.1反應(yīng)溫度和時間對納米晶的影響水熱合成法是指在高溫、高壓條件下,以水溶液或水蒸氣等流體為反應(yīng)體系,進(jìn)行水熱反應(yīng)來合成超微粉的一種方法。水熱法合成UCNPs也引起了人們的高度重視。清華大學(xué)的李亞棟教授課題組在這方面做出了突出貢獻(xiàn),他們先將稀土硝酸鹽水溶液加入到油酸或者亞油酸、水、乙醇和氫氧化鈉的微乳體系中,在攪拌條件下逐漸加入NaF的水溶液,然后轉(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜,調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間來控制納米晶的形貌。他們利用這一方法制備了一系列尺寸可調(diào)的、不同形貌(球形、立方塊、棒狀)的UCNPs。Zhang等利用水熱法合成出了UCNPs(主要成分為NaYF4)納米棒、納米管和花狀納米盤。發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)溫度小于160℃時,主要生成立方相NaYF4(α-NaYF4);隨著反應(yīng)溫度的升高和時間的延長,α-NaYF4溶解并重結(jié)晶成六方相NaYF4(β-NaYF4),即由亞穩(wěn)態(tài)的α-NaYF4過渡到穩(wěn)態(tài)的β-NaYF4,這個過程是不可逆的。在β-NaYF4生成的過程中,可以通過調(diào)節(jié)NaF和NaOH濃度等反應(yīng)參數(shù)來制備β-NaYF4納米棒、納米管和花狀納米盤。最近,Wang等研究了Gd3+摻雜濃度對NaYF4晶相和發(fā)光性能的影響。由于Gd3+離子極化半徑比較大,因此β相比較穩(wěn)定。而Y3+的離子極化半徑相對較小,傾向于α相;只有在比較苛刻的條件下,比如長時間高溫水熱條件才能生成β-NaYF4。在NaYF4晶體中引入Gd3+,可以促使β-NaYF4的快速生成。同時,又因?yàn)樯限D(zhuǎn)換發(fā)光效率對晶相有很強(qiáng)的依賴性,因此也可以通過改變Gd3+的摻雜濃度來調(diào)節(jié)UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率。1.2合成ucnps的機(jī)理三氟乙酸稀土鹽熱分解法的典型過程為:先制備各種三氟乙酸稀土鹽,將它們添加到高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑(油酸/1-十八烯、油酸/油胺、純油胺等體系),氮?dú)獗Ｗo(hù)下升溫到250~340℃,使三氟乙酸稀土鹽熱分解生成稀土氟化物納米材料;也可先將高沸點(diǎn)有機(jī)溶劑升溫到250~340℃,再注入三氟乙酸稀土鹽溶液來熱分解制備稀土氟化物納米材料。北京大學(xué)嚴(yán)純?nèi)A教授課題組首先利用這種方法制備了單分散的LaF3三角納米盤,隨后通過改變有機(jī)溶劑的比例、溫度、加熱時間等條件,制備了各種形貌可控的、不同晶相的稀土發(fā)光材料,并研究了這種方法的合成機(jī)理。他們認(rèn)為,在不同的有機(jī)溶劑體系中,稀土離子的成核自由能是不同的,這直接決定了UCNPs的相結(jié)構(gòu)。例如對于Pr和Nd,在油酸/1-十八烯的熱解體系中,成核自由能高于α-NaREF4的能壘,所以就很難形成α-NaREF4,但是容易形成棒狀的β-NaREF4;但是在油酸/油胺/1-十八烯的熱解體系中,其成核自由能低于α-NaREF4的能壘,就可以形成α-NaREF4。只要有油胺存在,所有稀土離子的成核自由能都比較低,可以同時形成α-NaYF4和β-NaYF4,這2種晶相都比較穩(wěn)定;但是在高溫反應(yīng)條件下更容易形成β-NaREF4。例如,新加坡國立大學(xué)(theNationalUniversityofSingapore)的Chow教授課題組就利用純油胺體系,在320℃的溫度條件下,制備了晶相均一、發(fā)光效率較高、單分散的UCNPs(β-NaYF4∶Yb/Er和β-NaYF4∶Yb/Tm)。Boyer利用這種方法,也制備了形貌可控的UCNPs。1.3鹽析+蒸發(fā)法edta沉淀法是將沉淀劑加入到混合金屬鹽溶液中,促使各組分均勻混合沉淀,然后經(jīng)過過濾、洗滌、干燥,再在一定的溫度和氣氛下燒結(jié)而得到納米發(fā)光粉。此法工藝易于控制,易工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。Yi等利用共沉淀法將稀土離子和乙二胺四乙酸(EDTA)的混合物快速注入到NaF鹽溶液中,產(chǎn)生NaYF4納米晶沉淀。通過調(diào)節(jié)EDTA和稀土離子的摩爾比可使顆粒尺寸在37~166nm調(diào)控。在近紅外光激發(fā)下,所獲得的NaYF4納米晶只能發(fā)出很微弱的上轉(zhuǎn)換熒光,但是經(jīng)過400~600℃的退火處理之后,發(fā)光強(qiáng)度提高了約40倍。經(jīng)過600℃的退火之后,NaYF4納米晶的上轉(zhuǎn)換發(fā)光最強(qiáng),但是它們會團(tuán)聚在一起。而在400℃退火后,NaYF4納米晶的顆粒尺寸和退火前的一樣。另外,Heer等和Zeng等課題組用高溫液相沉淀法合成了NaYF4∶Yb/Er(Tm)、LuPO4∶Yb/Tm和YbPO4∶Er納米晶,這些UCNPs形貌均勻,尺寸可控,表面都有疏水的長鏈配體。2微膠囊的ucnps雖然UCNPs的制備方法很多,但是所獲得的UCNPs的表面通常為疏水的有機(jī)配體(例如油酸),長的烷基鏈指向外層,導(dǎo)致它們不能溶于水,也難以與生物分子連接。所以,應(yīng)該發(fā)展一些表面修飾的方法來將疏水的UCNPs轉(zhuǎn)化成水溶性的、表面含有活性基團(tuán)(例如—COOH、—NH2或者—SH)的UCNPs。目前常用的表面修飾方法主要有5種:SiO2包裹法、配體交換法、聚合物包覆法、靜電層層自組裝法和配體氧化法。SiO2包裹法是采用SiO2包裹UCNPs,這種方法比較成熟,應(yīng)用廣泛。新加坡國立大學(xué)的Zhang等較早開展這方面的工作,成功地制備了SiO2包裹的UCNPs(β-NaYF4∶Yb,Er/Tm),UCNPs尺寸分布均勻,顆粒間沒有團(tuán)聚現(xiàn)象,基本上每個SiO2殼內(nèi)只有一個納米顆粒。這種方法對工藝的要求較高,難以精確控制包裹層的厚度或者形貌。配體交換法是通過配體交換的方式制備親水性的UCNPs,這類方法主要采用配位能力較強(qiáng)、多功能的有機(jī)配體來取代UCNPs表面配位能力較弱、疏水的有機(jī)配體。Chow課題組利用兩端為羧酸的聚乙二醇取代UCNPs表面的油胺配體,制備了親水性的、羧酸功能化的UCNPs,配體上自由的羧酸可用于連接生物分子。但是這種方法的交換效率很難確定。聚合物包覆法是利用兩親性的聚合物疏水端和UCNPs表面的疏水配體之間的范德華力,再加上親水端的親水作用,形成一個疏水/親水的有機(jī)核-殼結(jié)構(gòu)。這樣既解決了水溶性和官能團(tuán)的問題,又可以減弱水對UCNPs的熒光淬滅效應(yīng)。例如,Chow課題組將商用的聚丙烯酸經(jīng)過25%的辛胺和40%的異丙胺改性后,包覆在疏水的UCNPs表面,制備了具有疏水/親水的有機(jī)核-殼結(jié)構(gòu)的UCNPs。這種方法工藝相對比較復(fù)雜。靜電層層自組裝法首先在疏水的UCNPs表面吸附一層帶電的聚合物,然后再將其加入帶異種電荷的聚合物溶液,這樣2類聚合物因帶有異種電荷就互相吸引。如此依次吸附,2種聚合物就可以在UCNPs的表面交替組裝成有機(jī)殼層。通過改變吸附層數(shù)可以調(diào)控有機(jī)殼層厚度,從而優(yōu)化UCNPs在水溶液中的穩(wěn)定性和生物體內(nèi)的兼容性。李亞棟教授課題組先在UCNPs表面吸附一層帶有銨基鹽酸鹽基團(tuán)的PAH,然后將其加入帶有磺酸鈉基團(tuán)的PSS聚合物溶液,由于銨根離子帶正電,磺酸根離子帶負(fù)電荷,2種高聚物通過靜電作用相互吸引。這種方法操作步驟繁瑣,不易控制。配體氧化法是筆者課題組發(fā)展的一種新型表面修飾方法。筆者利用Lemieux-vonRudloff試劑(KMnO4+NaIO4水溶液)將UCNPs表面的油酸配體氧化成壬二酸配體,就可得到親水性的、羧酸功能化的UCNPs,如圖1所示。氧化過程對UCNPs的形貌、晶相、組成和發(fā)光性能沒有明顯的負(fù)面作用。FTIR和NMR測試結(jié)果表明,UCNPs表面產(chǎn)生了大量羧酸基團(tuán)。羧酸基團(tuán)的存在不僅使UCNPs具有良好的水溶性,而且可以和許多生物分子例如鏈親合素直接偶聯(lián)。這種方法適用于本身不會被氧化、但是表面配體含有碳碳不飽和鍵的納米材料,例如表面有油酸或者亞油酸的稀土納米材料。3對原理的轉(zhuǎn)換早期的研究中,人們將大顆粒的(幾百納米)稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料用于免疫組化、人絨毛膜促性激素的免疫層析圖譜分析和用于體外核酸分析。隨后,Lim等將150nm的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料用于線蟲的培養(yǎng),并對線蟲的腸做了掃描電鏡成像分析。但是值得說明的是,這些稀土發(fā)光材料的尺寸比較大,沒有合適的表面官能團(tuán),導(dǎo)致它們并不太適合用于細(xì)胞和動物成像。近5年,人們合成了一些尺寸較小、形貌可控的UCNPs,初步研究了它們的生物應(yīng)用,包括DNA傳感以及細(xì)胞和老鼠成像等。下面主要介紹筆者課題組在DNA納米傳感器、生物成像以及生物系統(tǒng)發(fā)電機(jī)這3類UCNPs應(yīng)用方面的研究進(jìn)展。3.1驗(yàn)證了ucnps的熒光共振能量轉(zhuǎn)移筆者課題組通過形成酰胺鍵將鏈親合素(streptavidin)連接在羧酸功能化的UCNPs(成分為NaYF4∶Yb,Er)表面,再利用這種UCNPs構(gòu)建了一種高度靈敏的DNA納米傳感器。這種DNA納米傳感器的設(shè)計(jì)原理見圖2,利用2個短的DNA序列來捕捉一個長的目標(biāo)DNA序列。2個短的DNA序列中,一個為含有生物素(biotin)的捕捉DNA序列,它通過生物素與鏈親合素之間的特異性作用而連接在鏈親合素功能化的UCNPs上;另一個為含有染料TAMRA的報(bào)告DNA序列,染料TAMRA的吸收譜與UCNPs的發(fā)射譜中綠色帶重疊,其發(fā)射峰大約位于580nm處。在streptavidin功能化的UCNPs、捕捉DNA和報(bào)告DNA的混合物溶液中,當(dāng)采用980nm連續(xù)激光器作為激發(fā)源時,僅能觀察到UCNPs的發(fā)光信號,說明了UCNPs與報(bào)告DNA之間的距離較遠(yuǎn),不能發(fā)生有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)在以上混合物溶液中緩慢加入目標(biāo)DNA后,同樣以980nm連續(xù)激光器作為激發(fā)源,可以觀察到一個位于約580nm處的寬發(fā)射峰逐漸出現(xiàn),對應(yīng)于TAMRA的發(fā)射,同時UCNPs的綠色發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸下降。以上現(xiàn)象說明發(fā)生了有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移,這是因?yàn)镈NA之間的組裝促使了UCNPs(能量給體)與TAMRA(能量受體)之間接近,由于TAMRA的吸收譜與UCNPs的發(fā)射譜中綠色帶重疊,UCNPs的綠色發(fā)射能量就會被TAMRA吸收,隨后TAMRA發(fā)光(約580nm處的寬發(fā)射峰)。另外發(fā)現(xiàn)在測量的濃度范圍(10~50nm)內(nèi),目標(biāo)DNA的濃度與發(fā)光峰的強(qiáng)度比(I580/I540或者I540/I654)存在線性關(guān)系,由于這里測量的目標(biāo)DNA濃度極低,說明了這個DNA傳感器擁有極高的靈敏度。這么高的靈敏度應(yīng)該歸因于在980nm激光器激發(fā)下,沒有任何背景熒光,僅有UCNPs能夠發(fā)光。3.2hela細(xì)胞區(qū)域熒光的觀察和分析筆者課題組首先將葉酸(FA)連接在一種表面有胺基的UCNPs上,隨后將2種癌細(xì)胞分別放在含67μg/mLUCNPs-FA的培養(yǎng)液中37℃孵育1h,這2種癌細(xì)胞是葉酸受體表達(dá)陽性FR(+)的宮頸癌(HeLa)細(xì)胞及葉酸受體表達(dá)陰性FR(-)的人乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞。當(dāng)使用980nm連續(xù)激光作為激發(fā)源時,可以觀察到來自HeLa細(xì)胞區(qū)域的綠色和紅色發(fā)光,光譜掃描分析表明這種發(fā)光來源于UCNPs的發(fā)光。HeLa細(xì)胞的明場照片能與熒光照片很好地重疊在一起,UCNPs主要分布在細(xì)胞膜區(qū)域。這是因?yàn)镠eLa細(xì)胞與UCNPs表面的葉酸具有強(qiáng)特異性作用。相反,同樣條件孵育的MCF-7細(xì)胞呈現(xiàn)極弱的熒光,這是因?yàn)镸CF-7細(xì)胞與UC-NPs表面的葉酸具有很弱的相互作用,因此只有極少量的UCNPs吸附在表面。值得注意的是,當(dāng)用980nm激光激發(fā)HeLa細(xì)胞時,僅觀察到UCNPs的發(fā)光,并沒有收集到生物樣品自發(fā)熒光。UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號強(qiáng)度大于4095,但是細(xì)胞核區(qū)的發(fā)光趨近于0。這是因?yàn)樯锝M織在980nm處的吸收極小,不會通過近紅外光激發(fā)產(chǎn)生熒光發(fā)射。因此,采用UCNPs作為發(fā)光標(biāo)記能完全消除生物體系自發(fā)熒光的干擾,同時也能避免其他染料的串色,擁有極高的靈敏度。3.3unps薄膜驅(qū)動的納米發(fā)電機(jī)用于激發(fā)UCNPs的近紅外光(例如980nm激光)具有較好的生物穿透性,對生物組織沒有破壞作用,因此進(jìn)入生物體內(nèi)的近紅外光作為一種驅(qū)動能源擁有非常光明的發(fā)電前景。筆者在傳統(tǒng)的染料敏化納米晶太陽能電池內(nèi)引入U(xiǎn)C