廣州管圓線蟲感染大小鼠腦組織中水通道蛋白4的表達

廣州管圓線蟲感染大小鼠腦組織中水通道蛋白4的表達

廣州管圓蟲病是廣州管圓蟲病引起的重要寄生蟲。廣州管圓線蟲是由我國著名寄生蟲學家陳心陶教授1935年從褐家鼠肺動脈中發(fā)現(xiàn)并命名的。大鼠是其適宜宿主,感染廣州管圓線蟲后癥狀不明顯。小鼠和人是非適宜宿主,感染廣州管圓線蟲后腦部炎癥表現(xiàn)明顯,主要表現(xiàn)為腦脊液中嗜酸性粒細胞增高性的腦膜炎和腦膜腦炎。有文獻報道,在感染者中大部分人存在顱內壓升高的情況,在治療后仍存在顱內高壓,而顱內壓升高的原因主要是腦水腫。提示,腦水腫的治療是治愈廣州管圓線蟲病的重要方面,而研究其發(fā)生的機制是治愈該病的基礎。水通道蛋白(aquaporin,AQP)是一類普遍存在于動植物及微生物細胞膜上,選擇性高效轉運水分子的通道蛋白。目前已從哺乳動物中鑒定出13種AQP,即AQP0~AQP12。近年來研究發(fā)現(xiàn),AQP-4與腦水腫的形成密切相關,而且在缺血的腦組織中AQP-4的表達顯著升高。然而,AQP-4在廣州管圓線蟲感染所致的腦水腫中的表達尚未有研究。因此,本研究擬通過檢測大小鼠感染廣州管圓線蟲后腦組織中AQP-4的表達水平,及小鼠用小膠質細胞抑制劑米諾環(huán)素處理后腦內AQP-4的水平和腦組織含水量,初步揭示AQP-4在廣州管圓線蟲病中的作用及機制,為廣州管圓線蟲感染引起的腦水腫的發(fā)病機制及優(yōu)化現(xiàn)有的治療方案提供實驗依據。1材料和方法1.1材料表面1.1.1國外品種見表1清潔級6周齡BALB/c小鼠(24只),雌性,體重18~20g;清潔級6周齡SD大鼠(12只),雌性,體重160~180g,由中山大學動物中心提供,合格證號:0098476。大鼠分為感染0d組(正常組)、感染7d組、14d組、21d組,每組3只。小鼠分為給藥+感染組(M-A組)和單純感染組(AC組),每組又分為感染0d組(即正常組)、感染7d組、14d組、21d組,每組均為3只小鼠。1.1.2感染期的幼蟲本實驗室已建立廣州管圓線蟲生活史循環(huán),感染期蟲體從感染的福壽螺體內獲得。1.1.3na反轉錄試驗劑米諾環(huán)素購自Sigma公司;Trizol購自Invitrogen公司;cDNA反轉錄試劑盒購自Fermentas公司;SYBR?FastMastermix(2×)RocheLightCycler?480qPCR購自Kapa公司;三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇均購自中山大學中山醫(yī)學院設備處供應科。1.2方法1.2.1米諾環(huán)素單次感染小鼠給藥方法如下:先將米諾環(huán)素用ddH2O溶解至濃度為200mg/ml,備用。除正常組外,其余小鼠在感染前2h腹腔注射米諾環(huán)素50mg/(kg·d),之后灌胃感染30條幼蟲。每天按此劑量腹腔注射給藥,直到小鼠處死。1.2.2篩網上殘留物將含有感染期幼蟲的福壽螺用刀、鑷子等工具破殼、取肉并充分剁碎、消化(每1L消化液中含胃蛋白酶2g、鹽酸7ml、蒸餾水993ml,37℃消化2h)。消化完畢后,懸液用200~300目篩網過濾,收集濾液。加3~4次ddH2O充分洗滌篩網上殘留物;將篩網上的殘留物棄去,濾液靜置30min以上,待蟲體沉底后,倒去大部分上清;吸取成渣,體視鏡下計數蟲體。除正常組外每只小鼠灌胃感染30條幼蟲,每只大鼠灌胃感染100條幼蟲。之后按清潔級標準正常飼養(yǎng),分別在感染后7、14、21d處死大小鼠,取腦組織進行后續(xù)實驗。1.2.3離心條件下合成rna酶將腦組織放入1mlTrizol中,在冰上充分研磨。之后,加入200μl三氯甲烷,在振蕩器上震蕩混勻,4℃13000r/min離心15min。將上清輕輕吸至新的去RNA酶EP管中,加入等體積的異丙醇,輕輕搖勻,4℃13000r/min離心10min。去上清,加入250μl用DEPC水配置的75%乙醇,4℃13000r/min離心1min(此步驟重復1遍)。風干剩余的乙醇,加入40μlDEPC水,吹打混勻,測濃度。1.2.4實時熒光定量pcrgactagct取5μgRNA按Fermentas反轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA,并以其為模板用SYBR?GreenⅠ摻入法進行RealtimePCR,以β-actin為內參,檢測AQP-4的表達水平。引物如下:大鼠AQP-4:F-TCTTCTGTCCTGACGTGGAG,R-CACCTCCATGTAGCTCCCTT(89bp);小鼠AQP-4:F-TACATGGAGGTGGAGGACAAR-CTCCACGGTCAATGTCAATC(94bp);因為大小鼠β-actin序列相似度非常高,故用同一對引物擴增:F-GGCATCCTGACCCTGAAGTA,R-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA(431bp)。RealtimePCR的反應體系參考試劑盒說明進行設置,20μl體系中加入0.5μl模板。反應條件為95℃預變性2min;95℃15s,60℃15s,72℃15s,40個循環(huán);95℃30s,60℃30s做溶解曲線,擴增結束。實驗在LightCycler480Real-TimePCRSystem中完成,采用2-△△CT法分析數據。1.2.5烘烤時間的測定小鼠處死后,迅速將腦取出并稱重,此重量為濕重。之后放入烘箱中,110℃烘烤24h,至恒重,取出后再稱重,此重量為干重。然后用以下公式計算腦組織含水量(%):(濕重-干重)/濕重×100%。1.3方差分析采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析,多組間比較采用one-wayanalysisofvariancel(ANOVA)方差分析,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1aqp-4在大鼠體內的表達情況大鼠感染廣州管圓線蟲后腦部雖也有炎癥,但程度較輕。大鼠腦內AQP-4的mRNA水平檢測顯示,感染后7d時AQP-4升高,是感染0d組(正常組)大鼠的2倍多(P<0.05)。但之后呈下降的趨勢,雖稍高于正常,但差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。2.2小鼠腦內和小鼠腦內aqp-4水平的變化小鼠感染廣州管圓線蟲后腦內炎癥明顯,并且隨著感染時間的延長而不斷加重。AQP-4mRNA水平檢測顯示,感染后7d,小鼠腦內AQP-4的水平升高,為正常組小鼠3倍多(P<0.01);且隨著感染時間的延長,到感染后14、21d,AQP-4的表達持續(xù)增加(P<0.01,圖2)。說明AQP-4的水平與炎癥發(fā)展趨勢呈正相關。2.3m-a的小鼠aqp-4表達水平的變化米諾環(huán)素是小膠質細胞的抑制劑。給藥后,小鼠AQP-4的mRNA水平被明顯抑制,表達水平顯著下降。感染后7d時,給藥組(M-A)小鼠的AQP-4表達水平與單純感染組(AC)小鼠比較明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在感染后14、21d時,AC組小鼠AQP-4水平也是明顯低于M-A組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖3)。2.4米諾環(huán)素對小鼠腦水腫的影響腦組織含水量是反應腦水腫的有效指標。感染廣州管圓線蟲后,小鼠出現(xiàn)腦水腫的癥狀,腦內含水量增加。應用米諾環(huán)素處理后,小鼠腦組織含水量有不同程度的下降。7d和14d組小鼠下降較明顯,且14d組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖4)。3小膠質細胞感染對腦水腫的影響本研究結果顯示,非適宜宿主小鼠感染廣州管圓線蟲后腦組織內AQP-4的水平明顯上升,在感染過程中均保持高水平。而適宜宿主大鼠卻只是在感染初期有輕度上升,后期則趨于正常。說明AQP-4在感染廣州管圓線蟲的不同宿主中的腦內表達存在差異,與廣州管圓線蟲感染引起的腦炎密切相關。本課題組前期研究結果顯示,廣州管圓線蟲四期幼蟲的蟲體抗原對大小鼠腦內小膠質細胞的活化存在差異,表現(xiàn)為對小鼠能產生更強的活化反應。因此,設想如果抑制小膠質細胞后,是否會使腦炎和腦水腫也減輕。本研究應用小膠質細胞的抑制劑米諾環(huán)素腹腔注射給小鼠,抑制小膠質細胞后,小鼠腦組織含水量較未給藥的單純感染組明顯下降,且AQP-4的水平也隨之下降。提示,AQP-4升高是廣州管圓線蟲感染后引起腦水腫的重要因素,抑制其增高可有效改善腦水腫,而小膠質細胞可能參與這一過程的調節(jié)。研究表明,AQP-4在腦內主要分布于星形膠質細胞、腦表面的軟腦膜、腦室系統(tǒng)的室管膜、脈絡叢、下丘腦的視上核和室旁核。但也有研究顯示,在反應性的小膠質細胞中AQP-4的mRNA和蛋白水平都高表達。本實驗通過抑制小膠質細胞使AQP-4的水平下降,從反面證明小膠質細胞與AQP-4有關。但本實驗還未獲得直接證據證明小膠質細胞產生AQP-4導致腦水腫。小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)固有的重要免疫效應細胞,與中樞炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展及轉歸關系密切。已有的研究結果也顯示,在廣州管圓線蟲感染小鼠腦內,小膠質細胞隨感染時間的延長而不斷活化。所以,通過抑制小膠質細胞既可以抑制炎