核盤菌寄生菌植病生防菌盾殼霉的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

核盤菌寄生菌植病生防菌盾殼霉的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

1947年發(fā)現(xiàn)的重要細(xì)菌是新菌核的薄皮病。在核盤菌的眾多生防菌中,盾殼霉由于具有分布廣泛、專一性強(qiáng)、作用時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)植物無致病性等特點(diǎn),被公認(rèn)為最具開發(fā)潛力的生防菌之一。歐洲市場(chǎng)上已有兩種盾殼霉制劑出售。近年來,國(guó)內(nèi)外有關(guān)盾殼霉的研究廣泛而深入,尤其是分子生物學(xué)方面的研究已經(jīng)逐步展開,并呈現(xiàn)出迅速發(fā)展的良好勢(shì)頭。作者于2004年曾就盾殼霉的研究進(jìn)行過總結(jié),但當(dāng)時(shí)分子水平的研究還很少。本文分別從產(chǎn)孢調(diào)控、與核盤菌相互作用、遺傳轉(zhuǎn)化、動(dòng)態(tài)檢測(cè)和遺傳多樣性等方面對(duì)盾殼霉分子水平的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。希望在此基礎(chǔ)上能夠促進(jìn)盾殼霉研究的不斷深入,同時(shí),能為其它相似真菌體系的研究提供借鑒之處。1突變體的產(chǎn)孢信號(hào)傳導(dǎo)分生孢子是盾殼霉在土壤中存活的主要形式、傳播的重要媒介和商業(yè)制劑中的主要成分,在盾殼霉的開發(fā)應(yīng)用中具有重要的意義。然而,以前的研究多集中在促進(jìn)產(chǎn)孢的環(huán)境因素方面,對(duì)產(chǎn)孢的分子基礎(chǔ)并不清楚。Li等從構(gòu)建的ATMT突變庫中篩選到98個(gè)產(chǎn)孢缺陷突變體。與野生型菌株相比,突變體除產(chǎn)孢能力缺失外,還在菌落形態(tài)、菌落色素或菌核致病力等方面表現(xiàn)出差異。在突變體ZS-1T1000中發(fā)現(xiàn)被破壞的基因編碼MAP激酶,這暗示著盾殼霉產(chǎn)孢是涉及信號(hào)傳導(dǎo)的復(fù)雜過程。在另一突變體ZS-1T2029中發(fā)現(xiàn)被破壞的基因?yàn)镃MCPS1(氨基甲酰磷酸合成酶基因),該基因編碼產(chǎn)物是鳥氨酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶。當(dāng)培養(yǎng)基中添加外源L-精氨酸或者硝普鈉(NO供體)時(shí),該突變體可恢復(fù)產(chǎn)孢;而在存在NG-硝基-L-精氨酸甲酯(NO合成酶抑制劑)時(shí),野生型菌株產(chǎn)孢受到抑制。由此推測(cè),CMCPS1的破壞阻斷了L-精氨酸(NO合成酶的底物)的生物合成,后者進(jìn)而影響了NO的產(chǎn)生,最終導(dǎo)致不能正常產(chǎn)孢。這種產(chǎn)孢介導(dǎo)方式在真菌中尚屬首次報(bào)道。然而,真菌的產(chǎn)孢受到光照、營(yíng)養(yǎng)、空氣、溫度和次生代謝物等因素的綜合影響,這必然涉及眾多生化途徑的調(diào)控,是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。我們相信隨著研究的深入一定還會(huì)有更多產(chǎn)孢相關(guān)基因被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。2重組菌的產(chǎn)生盾殼霉在土壤中通常呈休眠狀態(tài),只有在遇到菌核時(shí)或在被核盤菌侵染的植物病組織上才有活性。那么,盾殼霉是怎樣識(shí)別寄主的呢？Smith等研究了盾殼霉分生孢子和幼嫩菌絲與凝集素的親合性以及孢子表面的疏水性和靜電荷,認(rèn)為這些特性可能在盾殼霉與寄主的早期識(shí)別和結(jié)合中起作用。在盾殼霉基因組中含有與Magnaporthegrisea中PTH11類似的基因。該基因編碼產(chǎn)物為一種膜蛋白,在M.grisea中可以感知物體表面特性,進(jìn)而介導(dǎo)附著胞的分化。該蛋白編碼序列的存在暗示著它可能在盾殼霉與核盤菌的識(shí)別過程中起作用。盾殼霉對(duì)核盤菌的作用方式主要包括寄生作用、抗生作用和溶菌作用。Phillips和Price認(rèn)為盾殼霉在寄生核盤菌菌核和菌絲體過程中,存在著機(jī)械壓力和酶解兩種作用途徑。目前,已經(jīng)知道葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶在寄生菌核過程中發(fā)揮著非常重要的作用。此外,在盾殼霉發(fā)酵液中還可檢測(cè)到木聚糖酶和纖維素酶活性。Giczey等從盾殼霉中克隆了一個(gè)外切β-1,3-葡聚糖酶基因(cmg1),且在釀酒酵母中表達(dá)的重組酶對(duì)核盤菌菌絲生長(zhǎng)有抑制作用;在寄生菌核過程中,該基因的表達(dá)水平提高。Laroche等從盾殼霉中克隆到一個(gè)木聚糖酶基因cxy1(美國(guó)專利6121034),并在畢赤酵母中得到表達(dá)。此外,Laroche等和Giczey等還曾分別報(bào)道過一種外切β-1,3-葡聚糖酶基因cbeg1(美國(guó)專利6734344)和一個(gè)幾丁質(zhì)酶基因CH1(GenBank登錄號(hào)AF285086)。盾殼霉對(duì)菌核的寄生是一個(gè)復(fù)雜的涉及眾多生化反應(yīng)的過程。Muthumeenakshi等通過構(gòu)建SSH-cDNA文庫鑒定出與盾殼霉寄生菌核過程相關(guān)的251個(gè)非冗余EST序列,涉及信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞通訊、寄主細(xì)胞壁的降解與能量消耗、抗微生物代謝產(chǎn)物和毒素的合成、營(yíng)養(yǎng)利用、解毒和脅迫應(yīng)答以及一些功能未知基因等。在細(xì)胞壁降解相關(guān)酶類中,既有β-葡聚糖酶、α-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶,也有α-L-鼠李糖酶、甘露糖酶、木聚糖酶,乙酰木聚糖酯酶及肽酶。β-葡聚糖酶中,已發(fā)現(xiàn)有內(nèi)切-1,3和-1,4葡聚糖酶,以及外切-1,3和-1,4葡聚糖酶;α-葡聚糖酶中,已發(fā)現(xiàn)有內(nèi)切-1,3葡聚糖酶,以及外切-1,3,-1,4和-1,6葡聚糖酶。這種降解酶種類的多樣性,在一定程度上暗示了它們?cè)诩纳诉^程中的協(xié)同作用。此外,Roger等從4000個(gè)突變體中篩選到9個(gè)對(duì)核盤菌菌核的致病性降低或喪失的突變體,但未分離突變體中被破壞的基因。核盤菌分泌的草酸是其侵染寄主植物時(shí)的主要致病因子之一。研究發(fā)現(xiàn)盾殼霉可以降解草酸,并且草酸的降解與β-1,3葡聚糖酶的產(chǎn)量與活性呈正相關(guān);而該酶的產(chǎn)生在一定范圍內(nèi)與環(huán)境pH呈正相關(guān)。這可能意味著草酸的降解適當(dāng)提高了環(huán)境pH進(jìn)而誘導(dǎo)了β-1,3葡聚糖酶的產(chǎn)生,提高了該酶的活性。長(zhǎng)期以來,人們普遍認(rèn)為盾殼霉對(duì)核盤菌只存在寄生作用,而不存在抗生作用。導(dǎo)致這種誤判的原因可能是因?yàn)榭股镔|(zhì)的產(chǎn)生受到菌株、環(huán)境pH和營(yíng)養(yǎng)因子等的影響。盾殼霉可以產(chǎn)生抗細(xì)菌和抗真菌的次生代謝產(chǎn)物。目前,已從盾殼霉培養(yǎng)濾液中鑒定出至少3類代謝物質(zhì)：3(2H)-苯并呋喃酮類,色烷類和macrosphelideA。Muthumeenakshi等從盾殼霉中發(fā)現(xiàn)許多與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因,如聚酮類化合物合成通路相關(guān)基因,epipolythiodioxopiperazine類(ETP)真菌毒素(如gliotoxin和sirodesmin)生物合成的基因簇。閆帥發(fā)現(xiàn)一個(gè)與抗真菌物質(zhì)產(chǎn)生能力相關(guān)的基因(CMGPI-like1),其與曲霉(AspergillusfumigatusAf293)的GPI(糖基磷脂酰肌醇)錨定蛋白有較高的同源性。該基因破壞后,突變菌株除產(chǎn)抗真菌物質(zhì)特性發(fā)生改變外,在生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢能力、寄生致腐能力等方面跟出發(fā)菌株ZS-1相比也都產(chǎn)生了一定程度的差異,說明盾殼霉中的GPI蛋白不僅對(duì)盾殼霉產(chǎn)抗真菌物質(zhì)途徑具有調(diào)控作用,對(duì)其它途徑也可能具有一定的調(diào)控作用?？v觀目前的研究結(jié)果,可以認(rèn)為盾殼霉寄生菌核的過程可能涉及到機(jī)械壓力、抗生物質(zhì)和降解酶類的共同作用。3突變體的轉(zhuǎn)化在傳統(tǒng)的真菌遺傳分析中,常用物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)原始菌株產(chǎn)生突變,然后分析突變菌株的特性。例如,用紫外線照射盾殼霉的分生孢子,可獲得β-葡聚糖酶活性提高的菌株。根據(jù)適應(yīng)性變異和紫外線照射可獲得抗農(nóng)利靈和菌核凈的菌株。然而,常規(guī)方法獲得的突變體均為隨機(jī)突變,要從獲得的突變體中分離突變基因非常困難。近年,盾殼霉的DNA轉(zhuǎn)化已經(jīng)有了一定的進(jìn)展。Jones等首先建立了菌株A69的PEG-CaCl2原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法,獲得潮霉素B抗性基因(hph)和β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因(uidA)共表達(dá)的突變株。突變體均為多拷貝整合、具有較高的遺傳穩(wěn)定性,在培養(yǎng)形態(tài)、水勢(shì)敏感性以及菌核寄生能力等特性方面與野生型相似。相比PEG-CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,REMI和ATMT的轉(zhuǎn)化頻率和單拷貝整合事件都明顯提高。Roger等使用REMI和ATMT分別轉(zhuǎn)化菌株Conio的原生質(zhì)體和分生孢子。REMI對(duì)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率為常規(guī)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法的兩倍。ATMT對(duì)萌發(fā)的分生孢子的轉(zhuǎn)化效率高于未萌發(fā)的孢子;未萌發(fā)的分生孢子高度黑化,不適合直接用于ATMT轉(zhuǎn)化。常規(guī)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)化子沒有單拷貝整合,而REMI和ATMT獲得轉(zhuǎn)化子中單拷貝整合的頻率分別為8%和40%。Li等使用ATMT方法轉(zhuǎn)化菌株ZS-1的分生孢子,構(gòu)建了包含3萬個(gè)轉(zhuǎn)化子的突變體庫。研究發(fā)現(xiàn)孢子成熟度影響轉(zhuǎn)化效率,用在PDA上培養(yǎng)21d的孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)獲得轉(zhuǎn)化子的數(shù)目最多。獲得的突變體中單拷貝插入的頻率達(dá)到82.7%,并且篩選到四種類型的突變體(產(chǎn)孢缺陷突變體、致病缺陷突變體、色素改變突變體和抗生素缺陷突變體)。高頻率單拷貝突變體的獲得為相關(guān)基因的克隆和功能研究提供了很大的便利。除此之外,綠色熒光蛋白作為一種重要的報(bào)告基因,在病原菌與寄主的互作及對(duì)環(huán)境微生物的監(jiān)測(cè)等諸多方面均顯示了良好的應(yīng)用前景然而迄今還未用于轉(zhuǎn)化盾殼霉。4織物上的盾殼霉研究群體動(dòng)態(tài)常常需要使用特殊的選擇性標(biāo)記物或特殊的菌株。利用農(nóng)利靈抗性菌株SV-5-2并用含農(nóng)利靈、青霉素和鏈霉素的選擇培養(yǎng)基可以檢測(cè)油菜花瓣上或土壤中的盾殼霉。Jones等用構(gòu)建的含潮霉素B抗性基因的突變體研究盾殼霉的存活和對(duì)菌核的侵染,發(fā)現(xiàn)潮霉素B抗性可以區(qū)分土壤中的突變體和自然菌株,也能用于從腐爛菌核中分離盾殼霉。然而,用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法比較費(fèi)時(shí)。Ridgway和Stewart用為菌株A69設(shè)計(jì)的PCR檢測(cè)方法,可以特異研究該菌株在土壤中的生態(tài)學(xué),但還做不到準(zhǔn)確定量。如果能夠建立實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)體系,將有助于準(zhǔn)確評(píng)估盾殼霉在環(huán)境中的菌量變化。5菌株穩(wěn)定特性分析盾殼霉的不同菌株在菌落形態(tài)、色素顏色、分生孢子器的大小、多少及著生方式,寄生致腐菌核能力等方面存在明顯差異。根據(jù)這些特征,許多學(xué)者分別將采集的菌株分為不同的菌落類型。然而,這些基于形態(tài)特征的劃分容易受到環(huán)境條件的影響,無法作為鑒定菌株的穩(wěn)定特征,而分子標(biāo)記被證明是分析遺傳多樣性的有利工具。Grendene等發(fā)現(xiàn)AFLP、RAPD和形態(tài)生理特征均可區(qū)分供試的8個(gè)菌株,3種方法之間沒有緊密的對(duì)應(yīng)關(guān)系,但AFLP法較RAPD法和形態(tài)生理特征分析對(duì)檢測(cè)盾殼霉種內(nèi)變異和田間動(dòng)態(tài)更有效、更可靠。Muthumonakshi等對(duì)代表8種菌落類型的48個(gè)菌株進(jìn)行SSR-PCR和ITS序列分析,結(jié)果表明盾殼霉菌株間多態(tài)性水平相對(duì)較低,菌落類型或其它特性與SSR-PCR或ITS分析之間沒有必然的聯(lián)系。Goldstein發(fā)現(xiàn)盾殼霉菌株之間RAPD圖譜存在差異,且菌株A69有一條1.4kb的特異條帶。測(cè)序發(fā)現(xiàn)該條帶含有兩個(gè)114bp的重復(fù)片段和一些8bp～11bp的短重復(fù)序列。從該段序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增可以得到A69特異的圖譜。6聚糖酶基因pa程家森等和周浩等從盾殼霉中發(fā)現(xiàn)一種totiviridae科的雙鏈RNA真菌病毒(CmRV)。它可以通過無性繁殖傳遞給子代,但菌株間的傳遞受到營(yíng)養(yǎng)親合性的限制;它對(duì)寄主不產(chǎn)生明顯影響。Dihiya和Nigam從盾殼霉中純化到一種漆酶,具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。Lu等將盾殼霉的木聚糖酶基因cxy1用ATMT法成功轉(zhuǎn)入擬南芥,得到2個(gè)表達(dá)cxy1的突變株,為研究植物對(duì)核盤菌的抗病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。盾殼霉可以在較高pH條件下生長(zhǎng)(pH2-12),因此,克隆其耐堿相關(guān)基因可以為構(gòu)建耐鹽堿的作物提供基因材料。張祿從構(gòu)建的突變體庫中篩選到四個(gè)耐堿缺陷型突變體(在pH9的培養(yǎng)基中無法生長(zhǎng)),但沒有克隆到相應(yīng)的基因。7l-精氨酸調(diào)控產(chǎn)孢的途徑近30年來,關(guān)于盾殼霉的研究多集中在生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、生防機(jī)制以及發(fā)酵和應(yīng)用等方面。直到最近幾年才在分子水平進(jìn)行研究,但多角度廣泛開展研究并在某些方面具有很強(qiáng)的啟示性。例如,盾殼霉與核盤菌互作關(guān)系的研究可以為研究其它真菌-真菌相互作用提供很好的借鑒。雖然以前曾在Aspergillusnidulans中報(bào)道過L-精氨酸對(duì)產(chǎn)孢的促進(jìn)作用,但在盾殼霉中首次分析了L-精氨酸調(diào)控產(chǎn)孢的途徑,即通過著名的信號(hào)分子NO對(duì)產(chǎn)孢進(jìn)行調(diào)節(jié)。這提高了我們對(duì)其它真菌產(chǎn)孢調(diào)控的認(rèn)識(shí)。然而,目前也還存