梅毒實驗室診斷方法

梅毒實驗室診療梅毒的實驗室診療辦法重要有顯微鏡檢查法和血清學檢測法。一、顯微鏡檢查法〔一〕暗視野顯微鏡檢查【根本原理】梅毒硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損的滲出液涂片，以及淋巴結穿刺液涂片等，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊沿斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據其特別形態(tài)和運動辦法進行檢測?！緝x器材料】1．暗視野顯微鏡。2．鈍刀〔刮勺〕、載玻片、蓋玻片、注射器具、無菌生理鹽水?！緲吮静杉?．皮膚黏膜組織液：無菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦去皮損外表的污物，鈍刀輕刮、擠壓皮損表層，取滲出液與預先滴加在載玻片上的生理鹽水混合后加蓋玻片鏡檢。2．淋巴液：無菌操作下穿刺淋巴結，注入生理鹽水并重復抽吸2～3次，取少量的淋巴液直接滴于載玻片上，加蓋玻片鏡檢?！静僮鳝h(huán)節(jié)】1．加鏡油：在暗視野顯微鏡的聚光器上滴加鏡油。2．聚光：將標本玻片置載物臺上，上升聚光器使鏡油接觸載玻片底面。3．鏡檢：在鏡下觀察，尋覓有特性形態(tài)和運動辦法的梅毒螺旋體?！境晒凶x】梅毒螺旋體在暗視野顯微鏡鏡下體現(xiàn)為纖細、白色、有折光的螺旋狀微生物，長5～20m，直徑不大于0.2m，有6～12個螺旋，含有旋轉、蛇行及伸縮等三種特性性的運動辦法。暗視野顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有上述特性的螺旋體為陽性成果?！境晒麍蟾妗?．陽性：見到上述特性的梅毒螺旋體。2．陰性：未見到上述特性的梅毒螺旋體?！九R床意義】1．暗視野顯微鏡檢查陽性,可確診梅毒。2．螺旋體檢查是診療早期現(xiàn)癥梅毒的最佳辦法，世界衛(wèi)生組織指定為性病實驗室必備工程之一。3．如未見到梅毒螺旋體，并不能排解患梅毒的可能性，應復查和血清學檢查?！究记绊氈咳〔臅r盡量避免出血，以免影響鏡下觀察。取材后應立刻置暗視野顯微鏡下觀察。鏡下觀察時應注意與其它螺旋體相鑒別?！捕冲冦y染色檢查【根本原理】梅毒螺旋體含有親銀性，可被銀溶液染色，從而能夠在鏡下觀察到梅毒螺旋體?！緝x器材料】1．顯微鏡。2．羅吉氏固定液、鞣酸媒染劑、Fontana氏銀溶液?！緲吮静杉?.皮膚黏膜組織液：無菌生理鹽水浸濕的棉拭子擦去皮損外表的污物，鈍刀輕刮、擠壓皮損表層，取滲出液涂片。2．淋巴液：無菌操作下穿刺淋巴結，注入生理鹽水并重復抽吸2～3次，取少量的淋巴液直接滴于載玻片上?！静僮鳝h(huán)節(jié)】1．涂片枯燥：將標本涂于干凈載玻片作一薄片，于空氣中自然枯燥。2．固定：用固定液將涂片固定2～3分鐘。3．洗滌：用無水乙醇洗滌玻片上的油污。4．媒染：加媒染劑于涂片上，微加熱產生蒸汽，染30秒。5．銀染：水洗，加銀染液于涂片上，微加熱產生蒸汽，染30秒。6．鏡檢：水洗、待干，用油鏡檢查?！境晒凶x】顯微鏡下見到染成棕褐色的梅毒螺旋體為陽性成果?！境晒麍蟾妗?．陽性：見到染成棕褐色梅毒螺旋體。2．陰性：未見到染成棕褐色的梅毒螺旋體。【臨床意義】同暗視野顯微鏡檢查法?！究记绊氈繎⒁馀c其它螺旋體加以鑒別。二、血清學檢測法〔一〕非梅毒螺旋體抗原血清實驗非梅毒螺旋體抗原血清實驗，包含性病研究實驗室〔VDRL〕實驗、快速血漿反響素〔RPR〕環(huán)狀卡片實驗、甲苯胺紅不加熱血清實驗〔TRUST〕等。VDRL實驗【根本原理】梅毒螺旋體感染人體后，宿主會產生抗類脂抗原的抗體〔反響素〕，與必定比例的心磷脂、卵磷脂及膽固醇混合物抗原反響，可檢測梅毒患者血中的抗類脂抗原的抗體?！緝x器材料】1.水平旋轉儀、顯微鏡。2.試劑盒：VDRL抗原原液、VDRL緩沖液、抗原滴管及針頭、帶直徑14mm漆圈的玻璃反響板、VDRL實驗成果參考圖片。3.30mL平底玻璃小瓶、生理鹽水?！緲吮静杉垦澹撼槿§o脈血，室溫靜止凝固后，別離新穎血清。也可采納凍存的血清。腦脊液：采納腰椎穿刺術獲得，應由有關專業(yè)人員操作?！静僮鳝h(huán)節(jié)】VDRL抗原配制。VDRL玻片定性實驗〔1〕滅活：血清標本56℃〔2〕吸樣：吸取0.05mL血清放入反響板圈中，將血清涂布到整個圈內?！?〕加抗原：用原則針頭參加1滴抗原?！?〕反響：將反響板置水平旋轉儀上旋轉4分鐘，〔(180±5)次/分鐘〕，立刻置低倍顯微鏡下觀察。3.VDRL定量實驗〔1〕加稀釋液：在圈內參加0.05mL生理鹽水〔根據需要擬定稀釋度〕?！?〕樣本稀釋：吸取0.05mL樣本與各圈中鹽水作系列稀釋并涂布整個圈內?！?〕下列環(huán)節(jié)同定性實驗〔2〕～〔4〕?！境晒凶x】凝集反響強度分級：3＋～4＋：大的或中檔大小的絮狀物，液體清亮2＋：絮狀物較小，液體較清亮1＋：絮狀物較小，均勻分布，液體混濁±：抗原復合物顆粒稍粗－：抗原顆粒均勻、細小【成果報告】1．定性實驗：〔1〕陽性：鏡下可見1＋～4＋的絮狀凝集物?！?〕陰性：不產生凝集反響。2．定量實驗：滴度：鏡下可見絮狀凝集物的血清最高稀釋倍數(shù)?！九R床意義】對一期、二期、埋伏期和晚期梅毒患者的敏感性分別為78%、100%、96%和71%。腦脊液VDRL陽性對神經梅毒有診療意義?！究记绊氈?．VDRL用抗原需當天配制。2．實驗反響完畢，應立刻觀察成果。RPR實驗【根本原理】RPR實驗是VDRL實驗的一種改善辦法。該法在心磷脂、卵磷脂和膽固醇等構成的抗原中參加活性炭顆粒，與待檢血清〔漿〕中的反響素結合，形成肉眼可見的黑色絮狀物?！緝x器材料】1．水平旋轉儀。2．RPR試劑盒：RPR抗原、直徑為18mm圓圈的反響卡片、抗原滴管、針頭?！緲吮静杉?．血清：抽取靜脈血，室溫靜止凝固后，別離新穎血清。也可采納凍存的血清。2．血漿：多個抗凝劑制備的血漿?！静僮鳝h(huán)節(jié)】1．定性實驗〔1〕加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中，并均勻地涂布在整個圈內?！?〕加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭[每毫升〔60±1〕滴]加1滴抗原?！?〕反響：將卡片置水平旋轉儀旋轉8分鐘[〔100±5〕轉/分鐘]。立刻在亮光下觀察成果。2．定量實驗〔1〕稀釋液打算：在圈內參加0.05mL生理鹽水〔根據需要擬定稀釋度〕，勿將鹽水涂開?！?〕加樣：吸取0.05mL血清〔漿〕與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內?！?〕同定性實驗〔2〕～〔4〕?！境晒凶x】凝集反響強度分級：3＋～4＋：圓圈內出現(xiàn)中到大的黑色絮狀物，液體清亮2＋：圓圈內出現(xiàn)小到中的黑色絮狀物，液體較清亮1＋：圓圈內出現(xiàn)小的黑色絮狀物，液體混濁－：圓圈內僅見碳顆粒集于中央一點或均勻分散【成果報告】1．定性實驗：〔1〕陽性：出現(xiàn)1＋～4＋強度的凝集反響?！?〕陰性：不產生凝集反響。2．定量實驗：滴度：出現(xiàn)凝集反響的血清最高稀釋倍數(shù)。【臨床意義】1．RPR實驗合用于梅毒篩查、療效觀察、復發(fā)或再感染的檢查。2．對未經醫(yī)治的一期、二期和埋伏梅毒患者的敏感性分別為86%、100%和98%?！究记绊氈繉嶒瀾?3～29℃TRUST實驗TRUST實驗是用甲苯胺紅顆粒替代RPR實驗中的碳顆粒作為批示物，因此陽性成果為紅色絮狀物。其根本原理、儀器材料、標本采集、操作環(huán)節(jié)、成果判讀、成果報告、臨床意義及考前須知等與RPR實驗根本相似?！捕趁范韭菪w抗原血清實驗梅毒螺旋體抗原血清實驗是以梅毒螺旋體為抗原的特異性的抗原抗體反響，用以檢測梅毒抗體，慣用的辦法有梅毒螺旋體明膠顆粒凝集實驗〔TPPA〕、梅毒螺旋體血球凝集實驗〔TPHA〕、熒光梅毒螺旋體抗體汲取實驗〔FTA-ABS〕、梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附實驗〔TP-ELISA〕和梅毒螺旋體蛋白印跡實驗〔TP-WB〕等辦法。TPPA實驗【根本原理】TPPA實驗是用超聲裂解梅毒螺旋體制備的抗原，致敏明膠粒子，其致敏粒子與待檢血清中的抗梅毒螺旋體抗體結合，產生肉眼可見的凝集?！緝x器材料】1.微量震蕩器。2.試劑盒：“A〞溶化用液、“B〞標本稀釋液、“C〞致敏粒子、“D〞未致敏粒子、“E〞質控血清。3．U型反響板?！緲吮静杉客琑PR實驗?！静僮鳝h(huán)節(jié)】1．試劑打算：實驗前將待檢樣本和試劑應恢復到室溫。2．加稀釋液：每份樣本做4孔，加B液至反響孔內，第1孔100μL，第2～4孔各25μL。3．樣本稀釋：取血清25μL加至第1孔，混勻后取25μL至第2孔，持續(xù)倍比稀釋至第4孔，最后1孔混勻后棄去25μL。4．加對比液：第3孔加D液25μL，第4孔加C液25μL。5．混合：將反響板置震蕩器震蕩30秒。6．反響：置濕盒內，孵育2小時后，或放4℃【成果判讀】觀察凝集反響強度，分級以下：4＋：粒子光滑覆蓋整個孔底，有時邊沿有折疊3＋：粒子光滑覆蓋大局部孔底2＋：粒子光滑聚集覆蓋孔底，周邊有一細胞環(huán)1＋：粒子光滑集聚覆蓋孔底，周邊有一明顯細胞環(huán)±：粒子沉集孔底，中央形成一小點－：粒子緊密沉積孔底中央【成果報告】1．陽性：未致敏粒子不出現(xiàn)凝集〔第3孔〕，血清1︰80以上稀釋與致敏粒子產生1＋～4＋凝集反響。2.陰性：未致敏粒子和致敏粒子均不產生凝集反響?！九R床意義】1.TPPA可作為非梅毒螺旋體抗原血清實驗(如RPR等)初篩陽性標本確實證明驗。2．梅毒患者通過抗梅醫(yī)治后，TPPA實驗仍可陽性，故TPPA實驗陽性不能作為療效觀察的指標。3．TPPA陽性不能分辨既往感染和現(xiàn)癥感染，應結合非梅毒螺旋體抗原血清實驗成果進行診療?！究记绊氈?.實驗成果為“可疑〞時，應選用其它的實驗辦法進行復驗。2.如未致敏粒子出現(xiàn)凝集反響，樣本進行汲取后再進行實驗，或改用其它實驗辦法。TPHA實驗【根本原理】TPHA實驗用超聲裂解的梅毒螺旋體菌體為抗原，致敏經醛化、鞣化的羊或禽類紅細胞，與抗梅毒螺旋體抗體反響，產生肉眼可見的抗原抗體凝集?！緝x器材料】1.微量震蕩器。2．TPHA試劑盒：“A〞溶化用液、“B〞標本稀釋液、“C〞致敏粒子、“D〞未致敏粒子、“E〞質控血清。3.U型反響板?！緲吮静杉客琑PR實驗?！静僮鳝h(huán)節(jié)】1．試劑打算：實驗前試劑恢復到15～25℃2．加稀釋液：加B液至反響板，第1孔25L，第2孔100L，第3～5孔各加3．樣本稀釋：取血清25L加至第1孔，混勻后取25L至第2孔，混勻后取25L至第3孔，混勻后棄去25L，再從第2孔取254．加對比液：第3孔加D液〔未致敏細胞〕75μL，第4、5孔加C液〔致敏細胞〕各755．混合：將反響板置震蕩器震蕩30秒。6．反響：置濕盒內，15～25℃孵育4小時，或放4【成果判讀】同TPPA實驗?！境晒麍蟾妗客琓PPA實驗?！九R床意義】同TPPA實驗?！究记绊氈坑行┎杉{禽類紅細胞為載體的TPHA實驗，血清不用汲取，可直接進行實驗。FTA-ABS實驗【根本原理】以完整的梅毒螺旋體作為抗原，與經汲取劑汲取的梅毒血清抗體反響形成抗原抗體復合物，再參加熒光素〔FITC〕標記的抗人免疫球蛋白，形成帶有熒光的抗原抗體復合物，在熒光顯微鏡下螺旋體顯出蘋果綠色熒光?！緝x器材料】1．熒光顯微鏡。2．試劑盒：梅毒螺旋體抗原片、汲取劑、熒光素標記抗體、陽性對比血清、PBS緩沖液、固定劑。3.血清稀釋板?！緲吮静杉客琕DRL實驗?！静僮鳝h(huán)節(jié)】1.血清滅活：將血清標本于56℃2.血清稀釋：待檢血清用汲取劑1：5稀釋，陽性血清及陰性血清分別用PBS緩沖液和汲取劑1:5稀釋。置37℃3.加樣：每次實驗必須設PBS緩沖液、汲取劑、PBS液1︰5稀釋陽性和陰性血清及汲取劑1：5稀釋陽性和陰性血清共6個對比涂片。每個涂片分別參加10μL稀釋后的血清或緩沖液，置37℃4.洗滌：用PBS-Tween-80液洗玻片2次，每次5分鐘，最后用蒸餾水洗一次，冷風枯燥。5.加熒光抗體：每個涂片加10μL按規(guī)定稀釋的熒光抗體,置37℃6.洗滌：同環(huán)節(jié)4。7.封片鏡檢：用固定劑封片，讀片?！境晒凶x】1.陽性對比：無論PBS緩沖液還是吸附劑稀釋，熒光強度應相似。2.陰性對比和空白對比：不產生熒光?！境晒麍蟾妗?.陽性：熒光鏡下見到不同程度發(fā)綠色熒光的螺旋體。2.陰性：無熒光或密螺旋體微顯淡綠色?！九R床意義】1.FTA-ABS是梅毒螺旋體抗原血清學實驗的“金原則〞。2．對未經醫(yī)治的一期、二期、埋伏梅毒和晚期梅毒患者的敏感性分別為84%、100%、100%和96%，特異性均可達97%。3.其它同TPPA實驗?！究记绊氈?.抗原片每次洗滌要干凈，避免其它雜質影響判讀成果。2.實驗需有高質量熒光顯微鏡和技術純熟的操作人員。TP-ELISA實驗【根本原理】TP-ELISA實驗是用包被在固相板條上經超聲裂解、純化解決或重組的梅毒螺旋體抗原，與待檢血清中的梅毒特異性抗體結合，再與酶標記的抗人免疫球蛋白單克隆抗體反響，形成抗原抗體復合物而使底物顯色?！緝x器材料】1.酶標儀、洗板機。2．試劑盒構成：96孔反響板、標本稀釋液、洗滌液、酶結合物、底物液、終止液、陽性對比、陰性對比?！緲吮静杉客琑PR實驗【操作環(huán)節(jié)】1.加稀釋液：取標本稀釋液加到反響板孔內。2.孵育：分別參加陽性、陰性對比和待檢血清，置37℃3.加酶結合物：加酶結合物，置37℃4.加顯色劑：加底物，37℃5.終止反響：加終止液，酶標儀測OD〔光密度〕值?！境晒凶x】1．每次實驗的陽性、陰性對比應在規(guī)定的數(shù)值范疇內2．根據陽性、陰性OD值設定閾值〔cut-off值〕?！境晒麍蟾妗?．陽性：標本OD值不不大于或等于cut-off值。2．陰性：標本OD值不大于cut-off值?！九R床意義】〔1〕合用于流行病學調查或大樣本量標本的檢測?！?〕ELISA陽性不能分辨既往感染和現(xiàn)癥感染，應結合非梅毒螺旋體抗原血清實驗(如RPR等)成果進行診療?！究记绊氈?.不同批號試劑不能混用。2.溫度和時間必須嚴格操縱?！鯰P-WB實驗【根本原理】用超聲粉碎的梅毒螺旋體或梅毒螺旋體重組的不同抗原，印跡至硝酸纖維膜條上。通過酶聯(lián)反響，可檢測梅毒血清中多個特異抗原成分的抗體?！緝x器材料】1.水平搖床。2.試劑盒:硝酸纖維膜條、酶標抗體、陽性質控血清、陰性質控血清、底物液、終止液、原則陽性反響帶成果參比圖譜?！緲吮静杉客琑PR實驗【操作環(huán)節(jié)】1．反響：每反響槽加2.0mL工作緩沖液，浸濕膜條5分鐘，參加0.02mL待檢樣本，置水平搖床上(50轉/分)，18～25℃2．洗滌：棄去反響槽中液體，參加2.0mL工作緩沖液，置水平搖床洗滌3次，每次5分鐘。3．加酶結合物：參加酶標抗體，置水平搖床反響30分鐘。4．洗滌：同環(huán)節(jié)2。5．顯色：每槽加2.0mL底物，置水平搖床上反響8～10分鐘。6．終止:待陽性對比帶顯色清晰，參加1.0mL終止劑2分鐘后棄去槽中液體，用蒸餾水洗2次，用鑷子取出反響條，置濾紙上?！境晒凶x】1．根據陽性成果參比圖譜鑒定成果。2.將實驗的硝酸纖維膜條上端標記線與參比標記線對齊。3．觀察45KD、17KD及15.5KD帶區(qū)顯色帶?！境晒麍蟾妗?．陽性：45KD、17KD及15.5KD帶區(qū)均出現(xiàn)顯色帶。2．陰性：45KD、17KD及15.5KD三個條帶均未顯色?！九R床意義】1．同TPPA實驗2．能夠用于檢測IgM或IgG抗體?！究记绊氈?．洗滌要充足，否則易造成實驗膜條帶背景的顏色偏深。2．硝酸纖維膜條有對比反響條帶，在實驗中應顯示，如未顯示，則實驗無效。3．當45KD、17KD及15.5KD中只有一種或兩個條帶出現(xiàn)明顯色帶為可疑成果，需重新實驗?？焖倜庖邔游龇ā靖驹怼窟\用免疫層析原理，采納吸附有顯色標記的梅毒螺旋體重組抗原的濾紙條，快速檢測標本中的梅毒螺旋體抗體?！緝x器材料】試劑盒：測試板、一次性滴管?！緲吮静杉客琑PR實驗，可用全血?！静僮鳝h(huán)節(jié)】1．加樣：用一次性滴管滴加必定量標本于加樣孔中。2．加緩沖液：立刻參加必定量的緩沖液。3．觀察成果：規(guī)定時間內判讀成果?！境晒凶x】1.觀察質控條帶,推斷實驗有效性，如沒有出現(xiàn)質控條帶，闡明實驗無效，需重復實驗。2．觀察標本條帶?！境晒麍蟾妗?．陽性:出現(xiàn)標本條帶和質控條帶。2．陰性：無標本條帶，出現(xiàn)質控條帶?！九R床意義】1．能夠用于標本的快速篩查。2．快速檢測陽性不能分辨既往感染和現(xiàn)癥感染，應結合非梅毒螺旋體抗原血清實驗(如RPR等)成果進行診療?！究记绊氈?．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時，應平衡至室溫前方可使用。2．本實驗辦法存在必定的假陽性和假陰性。三、其它辦法〔一〕梅毒IgM抗體的檢測與其它細菌及病毒感染同樣，在梅毒中特異性IgM抗體的合成是第一次感染后的體液免疫應答。在梅毒中螺旋體IgM抗體出現(xiàn)在早期梅毒患者中，在埋伏期及晚期患者也能發(fā)現(xiàn)。在自發(fā)痊愈的患者中IgM水平下