條斑紫菜狀細(xì)菌的分離鑒定

條斑紫菜狀細(xì)菌的分離鑒定

1844年，歐石發(fā)現(xiàn)并命名了綠芝麻菌，屬于硫發(fā)生植物科。毛霉亮發(fā)菌是一種常見(jiàn)的形態(tài)獨(dú)特的海洋細(xì)菌,一般營(yíng)附著生活,常附著于海洋動(dòng)植物的體表。該菌在海水育苗和養(yǎng)殖中易引起疾病,給生產(chǎn)造成較為嚴(yán)重的損失。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)該菌的研究以蝦蟹類幼體的疾病為主。由于該菌的附著纏繞,使得蝦蟹類幼體活動(dòng)不便,呼吸和攝食受阻,導(dǎo)致生理機(jī)能下降和其它并發(fā)感染的發(fā)生,引起幼體大量死亡。條斑紫菜絲狀細(xì)菌附著癥是毛霉亮發(fā)菌附著在紫菜葉狀體表面而引起的病害。由于它形態(tài)似絲狀,故習(xí)慣上稱之為絲狀細(xì)菌附著癥。此癥最早由片山等報(bào)道,片山等和藤田等確認(rèn)其致病菌為毛霉亮發(fā)菌,并對(duì)該菌的微生物學(xué)、發(fā)生情況及環(huán)境條件進(jìn)行了調(diào)查研究。馬家海在我國(guó)江蘇省條斑紫菜栽培海區(qū)觀察到葉狀體上有絲狀細(xì)菌附著,此種病害在我國(guó)條斑紫菜栽培海區(qū)較為常見(jiàn),但至今尚未開(kāi)展深入的研究。本文研究了該病的病癥,并對(duì)其致病菌進(jìn)行了初步的研究,旨在為今后此癥的防治提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1測(cè)定法海水淡化在江蘇省南部一些發(fā)病嚴(yán)重的條斑紫菜栽培海區(qū)進(jìn)行多次采樣,將患病藻體用鹽度26.9的消毒海水清洗干凈,陰干,低溫條件下帶回實(shí)驗(yàn)室。取患病藻體進(jìn)行鏡檢、攝像。1.2調(diào)查海岸帶對(duì)江蘇省南部沿海條斑紫菜栽培海區(qū)進(jìn)行調(diào)查,了解發(fā)病情況及癥狀。1.3藻體的活化培養(yǎng)分離培養(yǎng)基使用Hoarld培養(yǎng)基。選取具有典型絲狀細(xì)菌附著癥癥狀的條斑紫菜葉狀體,經(jīng)無(wú)菌海水漂洗數(shù)次。漂洗后的藻體置于無(wú)菌海水中,用滅菌毛筆輕輕刷洗藻體表面,收集清洗液,稀釋成不同濃度的菌液,涂布于分離培養(yǎng)基平板上。24h后鏡檢指紋狀菌落,挑取并接種到另一平板,經(jīng)多次劃線純化培養(yǎng)得到絲狀細(xì)菌菌株YL。1.4實(shí)驗(yàn)條件與培養(yǎng)條件以分離獲得的絲狀細(xì)菌菌株YL對(duì)健康條斑紫菜葉狀體進(jìn)行感染試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)基本培養(yǎng)條件為:水溫15℃,鹽度為26.9,光照密度48.07~64.1μmol/(m2·s),光照周期14L∶10D,添加PES培養(yǎng)液充氣培養(yǎng),每天鏡檢、攝像。1.5形態(tài)觀察將純化的YL菌株分別接種于Hoarld固體和液體培養(yǎng)基,觀察其生長(zhǎng)情況及菌落特征,并進(jìn)行革蘭氏染色。1.6食物特性試驗(yàn)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)特性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)進(jìn)行。1.7通過(guò)不同的生態(tài)因素測(cè)定了菌株的生長(zhǎng)1.7.1錐形瓶調(diào)節(jié)Harold液體培養(yǎng)基鹽度分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100,分裝于25mL錐形瓶中。分別向不同鹽度培養(yǎng)液中接種YL菌株,于25℃靜置培養(yǎng),48h后分別取樣測(cè)定566nm處的OD值。1.7.2別為4、4.5、5.5、5.5、6.5、8.5、10.5、10.5、10.5、10.5、10.5、10.5、10.5用無(wú)菌的1mol/LNaOH和HCl調(diào)節(jié)Harold液體培養(yǎng)基的pH分別為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11,分裝于25mL錐形瓶中。分別向不同pH培養(yǎng)液中接種YL菌株,于25℃靜置培養(yǎng),48h后分別取樣測(cè)定566nm處的OD值。1.7.3節(jié)培養(yǎng)溫度接種YL菌株于Harold液體培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度(℃)分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45,靜置培養(yǎng)48h后,分別取樣測(cè)定566nm處的OD值。2結(jié)果2.1生長(zhǎng)和附著網(wǎng)狀細(xì)菌調(diào)查發(fā)現(xiàn),該病的發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng),從每年12月到翌年4月條斑紫菜生產(chǎn)中后期一直存在,通常隨著生產(chǎn)日期的推移,病勢(shì)越發(fā)加重。絲狀細(xì)菌的附著一般多見(jiàn)于秋苗網(wǎng)紫菜達(dá)到5cm以上的藻體,發(fā)病嚴(yán)重時(shí),1cm左右的紫菜葉狀體上也可發(fā)現(xiàn)。有時(shí),單孢子苗表面也大量附著絲狀細(xì)菌,感染嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致小苗死亡,條斑紫菜生產(chǎn)難以繼續(xù),給當(dāng)年的紫菜栽培帶來(lái)很大的影響。調(diào)查同時(shí)還發(fā)現(xiàn),在滸苔、石莼、礁膜等綠藻上也有絲狀細(xì)菌附著(圖版Ⅰ-1)。大量附著絲狀細(xì)菌的紫菜藻體,生長(zhǎng)衰竭且色澤低落呈淡褐色或淡黃色,常伴有早熟現(xiàn)象。病斑開(kāi)始呈綠色,后漸褪色。葉緣部分可見(jiàn)較多絲狀細(xì)菌附著,再擴(kuò)大至整個(gè)葉狀體表面,而且數(shù)量逐漸增多。隨著病勢(shì)的發(fā)展,葉狀體全體皺縮且從葉緣部開(kāi)始潰腐。大量附著絲狀細(xì)菌的藻體作為加工的原藻,光澤幾乎完全喪失,以致加工后的干紫菜質(zhì)量十分低下,嚴(yán)重地影響紫菜產(chǎn)品的品質(zhì),給生產(chǎn)造成了較為嚴(yán)重的損失。海區(qū)調(diào)查表明,絲狀細(xì)菌的大量附著一般出現(xiàn)在生產(chǎn)的中后期,這一時(shí)期的海水溫度大多在8~20℃之間,且呈逐漸上升的趨勢(shì)。藻體患病的嚴(yán)重程度,一般低潮區(qū)重于中、高潮區(qū);近岸的重于外海的;栽培密度大和海流緩慢的海區(qū)重于密度較稀、潮流較急的海區(qū)。2.2抗菌體的生長(zhǎng)鏡檢發(fā)現(xiàn),藻體的表面附著了大量的絲狀細(xì)菌,特別是藻體的邊緣較為明顯(圖版Ⅰ-2)。該菌菌絲體長(zhǎng)度不一,一般為10μm~5mm,直徑1~2μm。菌絲體無(wú)色、不分枝、不運(yùn)動(dòng),無(wú)鞘,成熟的菌絲呈串珠狀(圖版Ⅰ-3),大量的絲狀細(xì)菌往往會(huì)纏繞生長(zhǎng)或形成纏結(jié)(圖版Ⅰ-3),這與伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)上對(duì)毛霉亮發(fā)菌的形態(tài)描述相一致。絲狀細(xì)菌的一端附著于藻體上,另一端向外生長(zhǎng)。其基部可以進(jìn)入細(xì)胞壁表層,但不穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部(圖版Ⅰ-4)。絲狀細(xì)菌大量附著的部位,藻體細(xì)胞的原生質(zhì)收縮,進(jìn)而瓦解死亡。大量的死細(xì)胞連成一片,患病部位碎爛,在海上很快隨著潮流、波浪流失。微生子往往成簇附著在藻體邊緣(圖版Ⅰ-5,7),而后附著量逐漸增多,微生子也逐漸生長(zhǎng)成為菌絲體(圖版Ⅰ-6)。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)有菌絲體形成的玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)附著在藻體邊緣(圖版Ⅰ-8)。隨著藻體表面附著絲狀細(xì)菌數(shù)量的逐漸增加,藻體細(xì)胞逐漸萎縮死亡(圖版Ⅰ-9~11),從而在藻體上出現(xiàn)病斑(圖版Ⅰ-12)。2.3網(wǎng)狀細(xì)菌感染法感染結(jié)果表明,分離純化的YL菌株對(duì)健康條斑紫菜進(jìn)行感染后,表現(xiàn)出典型的絲狀細(xì)菌附著癥的癥狀,與自然海區(qū)的病菜癥狀一致。感染的藻體呈淡褐色,病斑呈綠色,大量附著絲狀細(xì)菌的部位腐爛呈黃白色。感染初期,藻體表面有少量絲狀細(xì)菌附著,菌絲較短,呈簇出現(xiàn),主要在藻體的邊緣部位附著。隨著感染的進(jìn)行,絲狀細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛,大量的絲狀細(xì)菌密集生長(zhǎng),整株藻體均有菌絲體附著,病情進(jìn)一步發(fā)展,附著部位的細(xì)胞逐漸死亡解體,形成綠色的病斑,而后逐漸褪色潰爛,在藻體上形成孔洞。在感染試驗(yàn)中還觀察到,大量附生絲狀細(xì)菌的藻體常伴有早熟現(xiàn)象。感染后期的藻體上大量組織脫落,患病嚴(yán)重的藻體甚至已經(jīng)泛白死亡。附著于藻體表面的絲狀細(xì)菌為無(wú)色、不分枝的絲狀體,有些菌絲呈串珠狀。菌絲的一端附著于藻體表面,另一端游離于海水中。觀察發(fā)現(xiàn),菌絲的基部可以進(jìn)入細(xì)胞壁的表層,但是不穿透細(xì)胞壁。這與自然海區(qū)患病藻體上附著的絲狀細(xì)菌形態(tài)一致。從感染后發(fā)病的藻體上再次分離到與YL菌株相同的絲狀細(xì)菌。2.4絲綢細(xì)菌的生長(zhǎng)特征2.4.1微肝胰腺組織的生長(zhǎng)YL菌株在Hoarld固體培養(yǎng)基形成肉眼可見(jiàn)的半透明菌落,菌落無(wú)固定形狀。鏡檢發(fā)現(xiàn),散落在固體培養(yǎng)基上的微生子不斷生長(zhǎng)、彎曲在平板上逐漸形成指紋形狀(圖版Ⅱ-1,2)。而后,菌絲體繼續(xù)生長(zhǎng)纏繞,并向頂部堆疊,逐漸隆起形成菌落(圖版Ⅱ-3,4)。一般接種后14~16h可形成指紋狀結(jié)構(gòu),48h內(nèi)可以形成隆起形菌落。2.4.2液體培養(yǎng)基的微肝電泳將YL菌株接種于Hoarld液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),36h后發(fā)現(xiàn)液體變渾濁。在顯微鏡下可見(jiàn)許多微生子。微生子在液體中可相互靠近,聚集在一起形成玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)(圖版Ⅲ-1,2),這是毛霉亮發(fā)菌在液體培養(yǎng)中最顯著的特征。形成玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)的微生子為3~12個(gè)。微生子在形成的玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)中可以繼續(xù)生長(zhǎng),2~3d后可變長(zhǎng)形成菌絲。液體培養(yǎng)基中還可見(jiàn)單根菌絲體存在。菌絲體成熟時(shí)可在頂端、中部斷裂形成微生子(圖版Ⅲ-3,4)進(jìn)行增殖。菌絲體在液體培養(yǎng)基中可以形成獨(dú)特的繩結(jié)狀結(jié)構(gòu)。在培養(yǎng)基中,單根菌絲兩端相交,菌絲一端從上方越過(guò)另一端,形成1個(gè)繩結(jié)狀結(jié)構(gòu)(圖版Ⅲ-5,箭頭所指為繩結(jié)狀結(jié)構(gòu))。兩根菌絲體也可以相互纏繞形成繩結(jié)狀結(jié)構(gòu)(圖版Ⅲ-6,箭頭所指為繩結(jié)狀結(jié)構(gòu))。2.5糖液酶菌劑試驗(yàn)結(jié)果顯示,該菌為需氧革蘭氏陰性菌。該菌不能水解淀粉,接觸酶試驗(yàn)為陽(yáng)性,能利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖;不能利用瓊脂、乳糖、作為碳源。2.5.1yl菌株最適鹽度及鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明(圖1),YL菌株在鹽度為0的情況下不能生長(zhǎng)。YL菌株在鹽度為5~100之間均能生長(zhǎng),其最適鹽度為25~35。鹽度超過(guò)60后,雖然菌株仍可生長(zhǎng),但生長(zhǎng)速度迅速下降。2.5.2在不同的ph值下，絲狀細(xì)菌的生長(zhǎng)試驗(yàn)由圖2可見(jiàn),YL菌株適宜生長(zhǎng)的pH范圍為5.0~10.0,最適宜生長(zhǎng)的范圍為7.0~8.0,其中pH為8時(shí)生長(zhǎng)最為旺盛。2.5.3不同溫度下的絲狀細(xì)菌生長(zhǎng)試驗(yàn)由圖3可以看出,YL菌株的最適生長(zhǎng)溫度為10~25℃,尤其在15℃生長(zhǎng)最旺盛。3討論3.1認(rèn)定菌體形態(tài)特征YL菌株為無(wú)色絲狀體,無(wú)鞘、無(wú)鞭毛,在固體培養(yǎng)基中可形成指紋狀菌落,在液體培養(yǎng)基中可形成玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)和繩結(jié)狀結(jié)構(gòu)。初步判斷此菌株為毛霉亮發(fā)菌(Leucothrixmucor)。該菌有獨(dú)特的形態(tài)特征,從而使毛霉亮發(fā)菌的形態(tài)學(xué)鑒別成為可能。Brock首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道毛霉亮發(fā)菌形成獨(dú)特的繩結(jié)狀結(jié)構(gòu)(knot)。該菌的菌絲在液體培養(yǎng)基中長(zhǎng)到一定程度后,單根菌絲首末端相互纏繞或幾根菌絲體相互纏繞形成獨(dú)特繩結(jié)狀結(jié)構(gòu)。Brock認(rèn)為繩結(jié)狀結(jié)構(gòu)是由于菌絲體兩側(cè)生長(zhǎng)速度不相等,從而使菌體發(fā)生彎曲,繼而形成繩結(jié)狀結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)在其他絲狀細(xì)菌中并未發(fā)現(xiàn)。本文還發(fā)現(xiàn)不僅單根菌絲體可以形成繩結(jié)狀結(jié)構(gòu),兩根菌絲體也可形成繩結(jié)狀結(jié)構(gòu)。3.2藻體表面的附著特性研究表明毛霉亮發(fā)菌除可以附著于底棲甲殼類、無(wú)脊椎動(dòng)物以及蝦蟹類的卵和魚(yú)卵表面外,還可以附著于大型海藻表面,但其致病機(jī)制不同。萬(wàn)夕和等對(duì)中華絨螯蟹幼體絲狀細(xì)菌病的研究指出,絲狀細(xì)菌雖然附生在幼體的體表,并未對(duì)幼體產(chǎn)生直接的侵蝕或病理性損害,但會(huì)使其活動(dòng)攝食受阻引起死亡。Bland等研究發(fā)現(xiàn),毛霉亮發(fā)菌可附著在聚丙烯等無(wú)機(jī)物的表面,但附著的數(shù)量及長(zhǎng)度都要小于有機(jī)物為宿主時(shí)的數(shù)量和長(zhǎng)度,并推測(cè)這是由于海水中的碳源不能滿足毛霉亮發(fā)菌生長(zhǎng)所致。研究還表明同等條件下毛霉亮發(fā)菌更傾向于將藻體作為宿主。大型海藻可以為毛霉亮發(fā)菌的生長(zhǎng)提供碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),這是毛霉亮發(fā)菌成為紫菜絲狀細(xì)菌附著癥致病菌的前提條件之一。其次,毛霉亮發(fā)菌在不同藻類表面的附著情況也存在一定差異。Johnson等對(duì)馬紹爾群島藻類的觀察表明可附著毛霉亮發(fā)菌的紅藻種類多于綠藻、褐藻和藍(lán)綠藻的種類。Bland等指出,在不同的藻類體表,毛霉亮發(fā)菌的數(shù)量不同,紅藻門藻類附著的毛霉亮發(fā)菌數(shù)目比其他藻類高出20~30倍。此外,本文還觀察到菌絲體并未穿透細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,菌絲體生長(zhǎng)所需的碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能來(lái)自細(xì)胞壁和藻膠層。菌體營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)表明該菌可以利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖等作為其唯一碳源。而不同細(xì)胞壁組成成分的不同可能是其附著差異的原因之一;Bland還認(rèn)為某些藻類所產(chǎn)生的胞外抑菌物質(zhì)也可能是造成附著差異的原因之一。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)絲狀細(xì)菌附著的藻體還有其它病害同時(shí)發(fā)生的情況。這可能是由于絲狀細(xì)菌破壞了其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致藻體抗病性減弱所致。另外,楊銳等對(duì)條斑紫菜外生細(xì)菌的遺傳多樣性研究后指出,藻際微環(huán)境(phycosphere)的平衡與否是引起條斑紫菜病害的原因,大量附著極有可能使藻體的原有藻際微環(huán)境的平衡發(fā)生改變,繼而引起致病菌數(shù)量增多,導(dǎo)致藻體發(fā)生病變。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)微生子與已形成附著基(holdfast)的毛霉亮發(fā)菌都可以附著在紫菜葉狀體的表面。Brock觀察玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)微生子在相互聚集形成早期的玫瑰花環(huán)結(jié)構(gòu)后會(huì)逐漸生成附著基。本試驗(yàn)中也觀察到了此現(xiàn)象,且在感染早期,微生子與菌絲體往往成簇出現(xiàn)。這是否與形成附著基有關(guān)還需進(jìn)一步研究。到目前為止,仍未有對(duì)其附著基構(gòu)成的詳細(xì)報(bào)道。它以何種機(jī)理附著在機(jī)體表面,有待進(jìn)一步試驗(yàn)。3.3抗菌材料型的城市紫菜栽培中出現(xiàn)的一些目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紫菜病害的報(bào)道表明,無(wú)論是寄生性微生物引起的病害或是不良環(huán)境引起的生理性病害,都與海洋環(huán)境中的各種生態(tài)因子密切相關(guān)。馬家海指出,高水溫、風(fēng)平浪靜、潮流不暢、低比重等因素是助長(zhǎng)病害發(fā)生與發(fā)展的條件。楊銳等認(rèn)為紫菜外生菌組成與其生活環(huán)境密切相關(guān)。同時(shí),人為因素如筏架網(wǎng)簾設(shè)置過(guò)多過(guò)密等,也是造成病害頻發(fā)的原因之一。近年來(lái),由于我國(guó)紫菜栽培業(yè)的快速發(fā)展,海區(qū)栽培密度過(guò)大,導(dǎo)致每年都爆發(fā)不同程度的病害。關(guān)于上述各種因素對(duì)絲狀細(xì)菌附著的影響國(guó)內(nèi)尚未有報(bào)道。本文通過(guò)海區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn),絲狀細(xì)菌附著癥自12月份開(kāi)始,伴隨紫菜栽培中后期,直至4月份末條斑紫菜采收結(jié)束為止。此病與擬油壺菌病、赤腐病等嚴(yán)重