地黃寡糖對2型糖尿病大鼠血糖的影響

地黃寡糖對2型糖尿病大鼠血糖的影響

地黃是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)，已經(jīng)在中國用于治療糖尿病已有幾千年的歷史。地黃寡糖(Rehmanniaglutinosaoligosaccharide,ROS)是地黃的主要成分之一,具有改善造血、促進(jìn)免疫、抗腫瘤等作用。我們以往的研究證明ROS無論以腹腔注射或灌胃均可降低四氧嘧啶(ALX)糖尿病大鼠的血糖,對去胸腺大鼠及老年大鼠受損的糖代謝(impairedglucosemetabolism)有改善作用。由于成人糖尿病以2型糖尿病為主(占90%以上),本文主要研究ROS對2型糖尿病大鼠的作用及可能的機(jī)制,以期為其進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物1.2藥物、試劑和儀器地黃寡糖(ROS)由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院臨床藥理基地提供,其中四聚糖占60%,三糖占20%,其余為單糖或二糖。鏈脲佐菌素(批號:054K0624)和葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(批號:114K7027)購自Sigma公司;50%葡萄糖注射液(批號:20040601),蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科;鹽酸二甲雙胍(批號:020413),正安醫(yī)藥(天津)有限公司;鹽酸腎上腺素注射液(批號:0404051),天津金耀氨基酸有限公司;血糖檢測試劑盒(批號:1204121)、總膽固醇(TC)檢測試劑盒(批號:1104101)、甘油三酯(TG)檢測試劑盒(批號:1104111)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑盒(批號:1104091),四川邁克科技責(zé)任有限公司;胰島素放射免疫分析試劑盒(批號:20050420、20050520),北京市北方生物技術(shù)研究所;蒽酮(批號:980818),北京金龍化學(xué)試劑公司;鉬酸銨(批號:20021214),天津化學(xué)試劑四廠。1.4大鼠糖代謝或血糖檢測♀Wistar大鼠長期高脂肪飼料飼養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)大鼠2型糖尿病模型。高脂飼料的配方為:蛋黃2.5%、蔗糖20%、豬油10%、基礎(chǔ)飼料67.5%。以上述飼料飼養(yǎng)2～3個月后再以STZ(30mg·kg-1,ip)誘發(fā)糖尿病,STZ注射前大鼠禁食16h。注射后3～7d檢測血糖值,血糖值大于14mmol·L-1者納入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動物分為正常對照組、2型糖尿病模型組、ROS給藥組(100、200mg·kg-1·d-1)及二甲雙胍給藥組(200mg·kg-1·d-1)。正常對照組及2型糖尿病模型組給予等量生理鹽水,均為灌胃給藥,給藥22d后斷頭處死。選用♂Wistar大鼠,分為正常對照組、高血糖模型組、ROS給藥組(200mg·kg-1·d-1)及二甲雙胍給藥組(200mg·kg-1·d-1)。正常對照組及高血糖模型組給予等量生理鹽水,均為灌胃給藥。給藥6d后分別采用葡萄糖(2.5g·kg-1,ip)和鹽酸腎上腺素(300μg·kg-1,ip)誘導(dǎo)正常大鼠葡萄糖和腎上腺素性高血糖模型。實(shí)驗(yàn)期間2型糖尿病模型于末次給藥后禁食6～7h,乙醚麻醉,眼球后靜脈叢采血。0.1mol·L-1EDTA抗凝,立即離心并分離血漿用于測定;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時大鼠斷頭處死收集全部血液,立即離心并分離血漿用于測定或存于-70℃。對正常大鼠葡萄糖或腎上腺素性高血糖模型,給藥6d后于腹腔注射葡萄糖或腎上腺素前(0min)和注射30、60、120min后分別乙醚麻醉,眼球后靜脈叢采血。取禁食后血液,分離血漿,用GOD-PAP法測定。具體操作參見試劑盒說明書。結(jié)果以mmol·L-1表示。2型糖尿病實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭處死后采血,收集血漿進(jìn)行測定。血漿總膽固醇(TC)用COD-CE-PAP法測定,甘油三酯(TG)用GPO-PAP法測定,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)用PTA-Mg2+沉淀法測定。具體操作參見試劑盒說明書。結(jié)果以mmol·L-1表示。用放射免疫法進(jìn)行測定,具體操作參見試劑盒說明書。結(jié)果以μIU·ml-1表示。1.4.7葡萄糖-6-磷酸酶活性的測定據(jù)文獻(xiàn)方法略加修改。肝組織以5倍體積0.25mol·L-1蔗糖制成勻漿,粗勻漿于高速離心機(jī)上11000×g,4℃離心30min,上清液用于酶活性測定。酶反應(yīng)體系包括0.25mol·L-1蔗糖/1mmol·L-1EDTA(pH7.0),0.1mol·L-1葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽,0.1mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液(pH6.5),總體積0.3ml,將適量待測上清液加入反應(yīng)體系開始反應(yīng),37℃孵育5min。反應(yīng)終止時加入10%三氯乙酸2ml,冰浴冷卻,3000×g離心10min去除沉淀,再取0.5ml上清液測定無機(jī)磷含量(鉬酸銨法),根據(jù)酶活性單位定義計(jì)算葡萄糖-6-磷酸酶活性。酶活性單位定義:100ml酶上清液在37℃,5min水解產(chǎn)生1mg無機(jī)磷為1個酶活性單位(IU)。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,組間差異的顯著性用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1ros對小鼠血糖值的影響如Tab1所示,2型糖尿病模型組大鼠在整個實(shí)驗(yàn)過程中血糖值都明顯高于正常對照組,并且上升69.25%。與2型糖尿病模型組相比,ROS低劑量組(100mg·kg-1·d-1)d11血糖值下降10.78%,ROS高劑量組(200mg·kg-1·d-1)d11血糖值下降21.35%,但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;ROS低劑量組d22血糖值下降18.35%,ROS高劑量組d22血糖值下降36.15%(P<0.01);二甲雙胍組d11血糖值下降14.18%,d22血糖值下降20.49%,但統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無顯著性。2.2型糖尿病模型ros對hdl-c的影響如Tab2所示,與正常對照組相比,2型糖尿病模型組d22TC、TG明顯升高(P<0.01),HDL-C明顯降低(P<0.01)。與2型糖尿病模型組比較,ROS低劑量組d22TC、TG分別下降了16.32%和34.97%,高劑量組分別下降了15.79%和27.87%,下降趨勢與劑量關(guān)系不大。同時,與2型糖尿模型組比較,ROS低、高劑量組HDL-C水平均有增高(P分別<0.05和<0.01),分別上升了44.83%和43.10%。而陽性對照二甲雙胍組d22TC降低了22.63%,TG上升了8.20%,HDL-C上升了22.41%。2.3ros對d32肝糖原的影響如Tab3所示,2型糖尿病模型組大鼠肝糖原含量明顯低于正常對照組。ROS高劑量組d22肝糖原與2型糖尿病模型組相比增加了46.84%,但統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異無顯著性。ROS低劑量組和二甲雙胍組d22肝糖原含量與2型糖尿病模型組相比差別不大。2.4最大限度是利用過程中,p在0.1.1的基礎(chǔ)上測定,提出并證明了,領(lǐng)導(dǎo)力量即如Tab4所示,2型糖尿病模型組與正常對照組相比,G-6-Pase的活性升高(75.93%,P<0.01)。ROS低劑量組d22與2型糖尿病模型組相比,G-6-Pase的活性降低了14.19%,而ROS高劑量組降低了24.58%(P<0.01),呈一定的劑量依賴性。二甲雙胍組亦有類似作用,與2型糖尿病模型組相比降低了17.90%(P<0.05)。2.5大鼠輸注后d32胰島素含量在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中我們研究了ROS對2型糖尿病大鼠血漿胰島素含量的影響,如Tab5所示,各組2型糖尿病大鼠d0與正常大鼠相比胰島素含量相當(dāng),d22斷頭處死大鼠進(jìn)行胰島素檢測,與2型糖尿病模型組比較,ROS低劑量組d22胰島素含量上升了43.95%,ROS高劑量組d22胰島素含量上升了54.99%,而二甲雙胍組d22胰島素含量上升了19.31%,但差異均無顯著性(P>0.05)。2.6血糖峰值的變化如Tab6所示,對于腎上腺素性高血糖模型組,ROS(200mg·kg-1·d-1)給藥6d可降低血糖峰值,其中第120min的血糖值降低了26.33%,差異具有顯著性(P<0.05),二甲雙胍組降低了43.81%(P<0.01)。對葡萄糖性高血糖模型,ROS給藥6d后,也對血糖峰值有降低趨勢,第30min的血糖值降低10.73%,二甲雙胍組降低了8.37%,但與模型組相比較差異均無顯著性。3ros在2型糖尿病模型上的降血糖作用地黃作為治療糖尿病的四大“圣藥”之一,在中國用于治療糖尿病已有數(shù)千年歷史,而成年人糖尿病患者中又以2型糖尿病為主。2型糖尿病主要表現(xiàn)為胰島素抵抗為特征的葡萄糖代謝紊亂,同時伴有脂代謝紊亂,表現(xiàn)為血漿中TC、TG含量增多,HDL-C含量降低,表明葡萄糖穩(wěn)態(tài)(glucosehomeostasis)失調(diào)。本文在我們以往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察ROS對2型糖尿病大鼠血糖的影響及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用長期高脂飼料喂養(yǎng)及小劑量STZ注射可以成功誘發(fā)2型糖尿病模型,表現(xiàn)為血糖逐漸增高伴有TC和TG升高,HDL-C降低。ROS在2型糖尿病大鼠模型上灌胃給藥22d后能有效抑制血糖的上升趨勢,降低血糖水平,尤其是ROS高劑量(200mg·kg-1·d-1)組效果明顯,與2型糖尿病模型組相比差異有顯著性,在此次實(shí)驗(yàn)中降血糖作用優(yōu)于二甲雙胍。同時,ROS用藥22d后,有降低2型糖尿病大鼠血漿中TC、TG的水平和增加HDL-C水平的趨勢,一定程度上逆轉(zhuǎn)了2型糖尿病脂代謝紊亂。另外,在葡萄糖和腎上腺素致高血糖大鼠模型上,ROS給藥組血糖峰值均較未給藥的模型組有降低趨勢,表明ROS有潛在的降低餐后或生理性高血糖的作用,但這種作用與陽性對照藥二甲雙胍相比較弱。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出ROS對血糖的影響較溫和,給藥后立即降低血糖的程度較輕,但長期給藥的降血糖效果是肯定的。為了探討ROS為何在2型糖尿病模型上具有降血糖作用的機(jī)制,我們以它是否能促進(jìn)肝糖原的生成、抑制糖異生關(guān)鍵酶G-6-Pase活性和促進(jìn)胰島素分泌為切入點(diǎn)進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS灌胃治療2型糖尿病大鼠22d后有增加大鼠肝糖原含量和血漿胰島素水平的趨勢,并可降低G-6-Pase活性。分析這種作用的機(jī)制,我們認(rèn)為,ROS可能通過促進(jìn)胰島素分泌使肝糖原生成增加;通過降低G-6-Pase活性使糖異生減少,最終的效應(yīng)是使血糖下降。這種降血糖效應(yīng)不僅在2型糖尿病模型上見到,亦可在腎上腺素或葡萄糖所致的生理性高血糖模型上見到。至于ROS降低TC及TG的機(jī)制,我們認(rèn)為也可能與糖代謝改善有關(guān),但詳細(xì)機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。此外,我們在2型糖尿病大鼠造模的過程中觀察到用高脂飼料與STZ聯(lián)合誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠模型的方法具有成模后血糖值較穩(wěn)定、自身緩解較少的優(yōu)點(diǎn)。我們在造模的預(yù)實(shí)驗(yàn)中觀察到,通過尾靜脈注射STZ(30mg·kg-1)誘導(dǎo)大鼠2型糖尿病的成模率不如文獻(xiàn)報道的那么高,與腹腔注射的方式相比成模率相當(dāng)(60%左右)。另外,長期高脂飼料喂養(yǎng)和小劑量STZ腹腔注射這兩個因素在誘導(dǎo)2型糖尿病模型的過程中缺一不可。高脂飼料喂養(yǎng)2mon后血糖值與正常對照并無差別,必須有STZ誘導(dǎo);在用STZ誘導(dǎo)成功后(血糖值上升到14mmol·L-1以上),如果停用高脂飼料,則空腹血糖值5～7d后會恢復(fù)至正常水平(仍表現(xiàn)出“三多一少”的癥狀),因此這兩個誘導(dǎo)因素是相輔相成的。我們通過研究ROS對2型糖尿病動物模型和正常大鼠高血糖模型血糖水平的影響和研究2型糖尿病動物血脂、肝糖原含量、肝臟G-6-Pase活性及血漿胰島素水平的影響,得出以下結(jié)論:地黃寡糖(ROS)在2型糖尿病大鼠模型上具有降血糖、降血脂的作用,也有降低葡萄糖和腎上腺素致高血糖大鼠模型血糖的趨勢,一定程度上逆轉(zhuǎn)了糖尿病造成的糖代謝紊亂和脂代謝紊亂,其作用機(jī)制可能與促進(jìn)2型糖尿病大鼠肝糖原的合成、降低肝臟中升高的G-6-Pase活性和促進(jìn)胰島素分泌有關(guān),進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中。Wistar大鼠,普通級,體重180～220g,♀、♂兼用。由蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供,自由攝食進(jìn)水,飼料由該實(shí)驗(yàn)中心配制。室溫18～25℃。Vitalab21半自動生化分析儀,荷蘭VitalScientific公司;BP210S電子天平,賽多利斯有限公司;HP-8453紫外分光光度計(jì),美國惠普公司;IECMicrom