肺結(jié)核患者和伏感者cd8+記憶細(xì)胞的產(chǎn)生及分布特性研究

肺結(jié)核患者和伏感者cd8+記憶細(xì)胞的產(chǎn)生及分布特性研究

淋巴結(jié)（t）是一種嚴(yán)重的有害人類(lèi)健康感染。艾滋病加劇了結(jié)核病的流行,在非洲,大約50%的艾滋病患者患有活動(dòng)性結(jié)核病。雖然結(jié)核分枝桿菌感染人數(shù)眾多,只有5%～10%的感染者發(fā)病。抗結(jié)核保護(hù)性免疫主要依賴(lài)CD4+和CD8+T細(xì)胞。CD4+T數(shù)量減少及功能異常是艾滋病發(fā)病的主要機(jī)制,而艾滋病患者對(duì)結(jié)核病高度易感,證明CD4+T細(xì)胞免疫在抗結(jié)核免疫中起關(guān)鍵作用。CD4基因缺陷小鼠雖然在結(jié)核分枝桿菌感染早期抵抗力顯著降低,但中后期抗結(jié)核免疫力與正常小鼠相似,提示CD8+T細(xì)胞在結(jié)核免疫保護(hù)中也發(fā)揮了非常重要的作用。記憶T細(xì)胞對(duì)特異性抗原有記憶能力,壽命長(zhǎng),可在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存活并自我更新,當(dāng)再次遇到相同抗原后,可產(chǎn)生更快、更強(qiáng)和更有效的二次免疫反應(yīng)。這是因?yàn)橛洃汿細(xì)胞比初始T細(xì)胞需要抗原的濃度低,更容易被抗原激活,對(duì)共刺激分子的依賴(lài)性較低。記憶T細(xì)胞是機(jī)體預(yù)防細(xì)胞內(nèi)病原菌再次感染的基礎(chǔ),誘導(dǎo)記憶T細(xì)胞產(chǎn)生是高效疫苗必備的條件。到目前為止,對(duì)結(jié)核分枝桿菌抗原特異性記憶T細(xì)胞亞群在抗結(jié)核免疫中作用的了解還非常有限。本研究比較了活動(dòng)期結(jié)核病患者和潛伏感染者結(jié)核抗原特異性CD8+記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生和分布特性,為了解結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制及探索新的防治措施提供依據(jù)。1數(shù)據(jù)和方法1.1分離菌株在痰涂片培養(yǎng)hiv活動(dòng)期肺結(jié)核組為2009年11-12月間解放軍309醫(yī)院結(jié)核病研究所住院患者,男性13例、女性11例,年齡18～69(39±6)歲,經(jīng)痰涂片抗酸桿菌或結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性確診,無(wú)HIV感染、免疫缺陷疾病及惡性腫瘤。對(duì)照組為解放軍309醫(yī)院同期門(mén)診健康體檢者,經(jīng)結(jié)核特異性ELISPOT檢測(cè)確診為潛伏感染者,男性10例、女性12例,年齡20～66(37±4)歲。1.2細(xì)胞培養(yǎng)和抗體共刺激分子CD28、CD49d購(gòu)自BD公司,高爾基轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Monension購(gòu)自Sigma公司,Ficoll密度梯度淋巴細(xì)胞分離液和RPMI1640購(gòu)自Gibco公司,小鼠抗人CD8-PC5單克隆抗體購(gòu)自BeckmanCoulter公司,小鼠抗人CD107a-PE、CCR7-PE-Cy7、CD45RA-FITC單克隆抗體及同型對(duì)照抗體購(gòu)自BD公司。1.3方法1.3.1人類(lèi)獨(dú)特的核細(xì)胞pb農(nóng)村土地的分離采用Ficoll梯度離心法。1.3.2cd117a抗體的制備每孔200μlPBMCs細(xì)胞懸液中加入10μg/mlESAT-6、200ngCD28抗體、200ngCD49d抗體、2μmol/LMonension,10μlPE標(biāo)記的CD107a單克隆抗體,在5%CO2、37℃孵箱培養(yǎng)16～20h。1.3.3免疫rt-pc5和ccr7-pc7對(duì)耐藥抗體的要求培養(yǎng)16～20h后,PBMCs用含2%小牛血清的PBS(2%FBS-PBS)洗1次,加入3μlCD8-PC5單克隆抗體、2.5μlCCR7-PC7抗體、7.5μlCD45RA-FITC單克隆抗體,4℃避光染色30min。細(xì)胞用2%FBS-PBS洗1次,懸浮于500μl2%FBS-PBS中,4℃避光保存。1.3.4流式細(xì)胞儀分析熒光抗體染色后,用流式細(xì)胞儀(BeckmancoulterPC500)分析,獲取細(xì)胞數(shù)不少于100000。1.4統(tǒng)計(jì)處理采用GraphpadPrism軟件進(jìn)行Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1cd107a分子的表達(dá)與免疫部分脫顆粒是抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷功能的關(guān)鍵步驟。在特異性抗原刺激下,CD8+效應(yīng)T細(xì)胞迅速脫顆粒,在這一過(guò)程中,CD107a分子由胞內(nèi)出現(xiàn)在CD8+細(xì)胞表面,其表達(dá)水平的高低可直接反映抗原特異性CD8+T細(xì)胞脫顆粒狀況,從而反映了CD8+T細(xì)胞抗原特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)狀況。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)研究顯示,結(jié)核患者外周血CD8+T細(xì)胞在ESAT-6抗原刺激后,細(xì)胞表面CD107a表達(dá)顯著增高(圖1),而同型抗體對(duì)照表達(dá)水平非常低,可作為結(jié)核抗原特異性CD8+T細(xì)胞檢測(cè)的分子標(biāo)識(shí)。2.2t細(xì)胞超記憶采用ESAT-6抗原刺激結(jié)核病患者及潛伏感染者PBMCs,通過(guò)CD8、CD107a、CCR7、CD45RA抗體共染色,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)核抗原特異性CD8+記憶T細(xì)胞(圖2)。選擇CD8+CD107a+雙陽(yáng)性區(qū)設(shè)門(mén)分析抗原特異性T細(xì)胞亞群(圖2),進(jìn)一步根據(jù)CD45RA和CCR7表達(dá),可以將CD8+T細(xì)胞分為CD45RA-CCR7+中央記憶T細(xì)胞(centralmemoryTcells,TCM),CD45RA-CCR7-效應(yīng)記憶T細(xì)胞(effectormemoryTcells,TEM)和CD45RA+CCR7-效應(yīng)記憶T細(xì)胞(CD45RA+effectorTcells,TEMRA)(圖2)。2.3tem細(xì)胞亞群分布頻率24例活動(dòng)性肺結(jié)核病患者及22例潛伏感染者的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),與潛伏感染人群相比,肺結(jié)核患者CD8+TEM細(xì)胞亞群分布頻率顯著降低[肺結(jié)核患者(38.14±3.87)%,潛伏感染者(52.34±2.95)%,P=0.0142,見(jiàn)圖3A。CD8+TEMRA細(xì)胞亞群分布頻率顯著增加[肺結(jié)核患者(59.94±3.87)%,潛伏感染者(46.65±2.88)%,P=0.0203,見(jiàn)圖3B。3cd8+t細(xì)胞檢測(cè)目前已知CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。以往檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞采用四聚體技術(shù),需要知道被檢測(cè)個(gè)體的MHC類(lèi)型以及事先篩選適合的抗原多肽;且制備四聚體技術(shù)復(fù)雜,選擇有限,應(yīng)用范圍受限;鑒定的抗原特異性細(xì)胞不一定具有免疫反應(yīng)功能。通過(guò)抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌來(lái)檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞,如用ELISPOT檢測(cè)INF-γ等,不能用于T細(xì)胞的純化和免疫功能分析;細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色方法不能獲得活細(xì)胞,且該技術(shù)不能用于檢測(cè)不產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞?？乖禺愋訡D8+T細(xì)胞在受到特異性抗原刺激后,活化的T細(xì)胞迅速脫顆粒,通過(guò)T細(xì)胞和靶細(xì)胞之間的免疫突觸釋放細(xì)胞溶解性顆粒,最終導(dǎo)致靶細(xì)胞的死亡?？乖禺愋訡D8+T細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)儲(chǔ)存著預(yù)先合成的細(xì)胞溶解性顆粒,如穿孔素和顆粒酶,包裹在含CD107a(LAMP1)等分子的脂質(zhì)雙分子膜內(nèi);當(dāng)T細(xì)胞釋放穿孔素、顆粒酶等分子時(shí),CD107a表達(dá)于T細(xì)胞表面。研究顯示,通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞表面的CD107a分子表達(dá)水平,可以直接反映抗原特異性CD8+T細(xì)胞的脫顆粒過(guò)程,從而反映T細(xì)胞的殺傷功能。本研究采用這一原理,建立了基于CD107a表達(dá)的抗原特異性CD8+T細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)。由于CD107a在活化脫顆粒過(guò)程中暫時(shí)表達(dá)于CD8+T細(xì)胞表面,難以標(biāo)記以進(jìn)行定量檢測(cè)。為了解決這一問(wèn)題,我們通過(guò)在刺激的同時(shí)加入熒光標(biāo)記的CD107a抗體共培養(yǎng),可以持續(xù)標(biāo)記細(xì)胞表面表達(dá)的CD107a分子。根據(jù)CD45RA和CCR7表面標(biāo)記,可將CD8+記憶T細(xì)胞可分為CD45RA-CCR7+TCM,CD45RA-CCR7-TEM和CD45RA+CCR7-TEMRA,其中TEM和TEMRA均為效應(yīng)記憶T細(xì)胞。以往研究顯示,抗原特異性TEMRA表達(dá)高水平的顆粒酶,可以直接溶解結(jié)核分枝桿菌寄生的巨噬細(xì)胞,抑制結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的增殖?？筎NF免疫治療導(dǎo)致的結(jié)核病發(fā)病率顯著增加可能與TEMRA數(shù)量下降密切相關(guān)。提示T