變應性鼻炎豚鼠模型鼻黏膜重塑的研究

變應性鼻炎豚鼠模型鼻黏膜重塑的研究

哮喘和慢性阻塞性肺病的主要特征是呼吸道粘膜的不可逆轉(zhuǎn)化，包括典型的組織和功能變化，如表皮破壞和鈣化、腺體增生、平滑肌病、，高反應性呼吸。目前,這種重塑改變在臨床上缺乏有效的預防和干預措施。變應性鼻炎和哮喘在流行病學、病原學、臨床特征、免疫學、病理生理學、疾病轉(zhuǎn)歸等方面都被認為是“同一氣道,同一疾病”。諸多學者從上、下氣道炎癥相關(guān)性研究鼻腔炎癥對上、下呼吸道重塑的影響。鼻黏膜細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)缺乏平滑肌成分,因此,鼻黏膜重塑特征有別與下呼吸黏膜的重塑特征。本研究主要通過變應性鼻炎豚鼠模型在變應原長期刺激作用下,動態(tài)觀察鼻黏膜的病理變化,揭示變應性鼻炎鼻黏膜的重塑特征,從而為呼吸道黏膜炎癥一致性以及鼻腔炎癥干預對下氣道重塑的影響提供理論依據(jù)。1材料和方法1.17年7月健康成年Hartley雄性豚鼠48只,體重250～350g,由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供[SYXK(軍)2007-029]。將實驗動物隨機分為6組,每組8只,實驗組用卵清蛋白(OVA)激發(fā),分為3組:OVA2W組(2周抗原激發(fā)組)、OVA6W組(6周抗原激發(fā)組)、OVA12W組(12周抗原激發(fā)組);各組設(shè)立生理鹽水對照組(Sal2W組、Sal6W組、Sal12W組),所有實驗步驟符合南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動物倫理委員會的要求。1.2離子蛋白及elisa試驗劑OVA(V級,Sigma),OVA特異性免疫球蛋白(OVA-sIgE)ELISA試劑盒和嗜酸粒細胞陽離子蛋白(eosinophicationicprotein,ECP)及ELISA試劑盒均購自Rapidbio公司。兔抗鼠TGF-β1抗體(1∶30,SantaCruz),生物素化山羊抗兔IgG工作液(二抗,武漢博士德)。Olympus醫(yī)學顯微鏡及多功能真色彩病理圖像分析系統(tǒng)(南京大學圖像中心)。1.3小鼠基礎(chǔ)致敏試驗變應性鼻炎豚鼠模型參照文獻制作:①基礎(chǔ)致敏(第1～13天):每只動物以0.3mgOVA作為致敏原,氫氧化鋁30mg作為佐劑,生理鹽水溶解形成1ml混懸液腹腔內(nèi)注射基礎(chǔ)致敏,隔日1次,連續(xù)7次;②強化致敏(第14～18天):以0.25%OVA生理鹽水溶液2ml超聲霧化吸入,每日1次,連續(xù)5d,強化致敏;③滴鼻激發(fā):間歇1周(第19～25天),從第26天開始,以2%OVA生理鹽水溶液0.1ml滴鼻激發(fā)。OVA2W組持續(xù)滴鼻2周,OVA6W組為間斷滴鼻6周,OVA12W組為間斷滴鼻12周。各組每周3次以2%OVA0.1ml滴鼻激發(fā)。以上步驟對照組均以生理鹽水代替OVA,其余與實驗組相同。1.4鼻黏膜的檢測各組動物均在最后一次滴鼻激發(fā)后24h,腹腔注射1%水合氯醛溶液麻醉。鼻腔灌洗:參考文獻的方法,取2ml經(jīng)37℃水浴箱預熱的PBS液經(jīng)氣管插管向動物鼻部灌洗(1ml/min),反復3次,鼻部下方收集灌洗液。將收集好的鼻腔灌洗液離心,收集的上清移至另一干凈Eppendorf管中,-20℃保存,準備測定相關(guān)指標。將豚鼠斷頭并去除皮膚,將連同鼻腔的上頜骨用4%中性甲醛固定、石蠟包埋。做3μm厚連續(xù)切片,行蘇木精-伊紅染色,觀察鼻黏膜上皮的損傷情況。采用AB-PAS染色,計數(shù)鼻黏膜單位面積上皮細胞中的杯狀細胞數(shù)。采用MT法染色,測定鼻黏膜基膜區(qū)膠原成分染色的面積百分率,每只動物取組織完整和染色良好的4張切片,光學顯微鏡下觀察(每張切片隨機觀察5個視野,取平均值),行組織病理學分析。1.5小鼠鼻黏膜免疫后抗體的檢測鼻黏膜組織轉(zhuǎn)移生長因子β1(TGF-β1)免疫組織化學檢測:鼻黏膜石蠟切片,分別滴加一抗(兔抗鼠TGF-β1抗體)、二抗(生物素化山羊抗兔IgG)工作液,DAB顯色,蘇木精復染細胞核。1.6鼻干洗溶液中的炎癥指標測定OVA-sIgE、ECP含量用ELISA法檢測,步驟按試劑盒說明書進行。1.7基膜暴露整株理念鼻黏膜切片蘇木精-伊紅染色,按上皮細胞的狀態(tài)分4級,0級:纖毛上皮無損傷,纖毛完整;1級:纖毛缺失,無上皮細胞剝脫;2級:上皮細胞剝脫但未至基膜;3級:上皮細胞全部剝脫,基膜暴露。測定各狀態(tài)下上皮細胞所占鼻黏膜面積的百分率,測定方法:高倍鏡下(×400)以各級上皮細胞所占基膜總長的百分率表示。1.8組實驗數(shù)據(jù)及比較應用SPSS13.0軟件行統(tǒng)計學分析,實驗數(shù)據(jù)采用xˉ±sxˉ±s表示,率的比較用χ2檢驗,組間比較用方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1鼻清洗中ecp和ova-sig含量的測定鼻灌洗液中ECP、OVA-sIgE含量的測定見表1。2.2鼻粘膜重建的評估2.2.1抗原刺激時間對皮質(zhì)組織病理學的影響實驗組鼻黏膜上皮細胞損傷以1級為主,有不同程度的2級以上損傷;對照組幾乎無2級和3級上皮損傷。實驗組早期上皮細胞水腫,隨著抗原刺激時間延長,黏膜上皮細胞出現(xiàn)鱗化,上皮細胞增生明顯,上皮排列失去極性,嗜酸粒細胞(EOS)浸潤隨抗原刺激時間延長有增多趨勢。2組鼻黏膜上皮細胞損傷程度的比較見表2。2.2.2鼻中隔黏膜單位面積生物量的檢測鼻黏膜石蠟切片AB-PBS染色腺體中糖原顆粒呈紅色反應,以此作為杯狀細胞計數(shù)。鼻黏膜中腺體隨著抗原刺激時間延長明顯肥大、增生,上皮內(nèi)杯狀細胞肥大、增生,尤其在下鼻甲黏膜內(nèi)更加明顯(圖1)。高倍鏡下(×400)記數(shù)鼻中隔黏膜單位面積上皮細胞中杯狀細胞數(shù)(個/mm2),OVA2W、OVA6W、OVA12W組分別為27.4±41.7、71.2±6.8、95.2±14.1,與OVA2W組比較,其他2組的杯狀細胞數(shù)明顯增多(均P<0.05)。Sal2W、Sal6W、Sal12W組杯狀細胞數(shù)分別為16.3±8.1、19.5±6.4、18.0±3.1,均較相應的實驗組明顯減少(均P<0.05)。2.2.3ecm膠原沉積鼻黏膜石蠟切片MT染色膠原呈藍色,作為ECM成分的標志。可見膠原成分沉積于黏膜基膜及腺體、血管周圍(圖2)。高倍視野下測量鼻黏膜基膜區(qū)下20μm厚度范圍內(nèi)MT染色藍色面積所占的百分率。OVA2W、OVA6W、OVA12W組ECM膠原沉積分別為(18.6±12.0)%、(22.9±9.3)%、(21.7±1.3)%,與OVA2W組比較,其他2組ECM膠原沉積明顯增多(均P<0.05)。Sal2W、Sal6W、Sal12W組ECM膠原沉積分別為(15.6±4.0)%、(13.5±2.5)%、(14.5±1.5)%,后2組ECM膠原沉積均較相應的實驗組明顯減少(均P<0.05)。2.3濃度對陽性染色細胞顆粒的影響TGF-β1主要表達在鼻黏膜基膜、腺體及血管周圍的細胞核及細胞質(zhì),少量表達在黏膜上皮細胞及炎性細胞的細胞核及細胞質(zhì),均呈棕黃色顆粒(圖3)。計算鼻黏膜基膜區(qū)下20μm厚度中陽性染色細胞的程度,通過圖像分析,結(jié)果用吸收度(A值)表示,A值越大,陽性染色細胞顆粒越多。OVA2W、OVA6W、OVA12W組A值分別為0.271±0.083、0.307±0.008、0.395±0.027,與OVA2W組比較,其他2組的A值明顯增大(均P<0.01)。Sal2W、Sal6W、Sal12W組A值分別為0.225±0.090、0.238±0.026、0.203±0.041,與相應的實驗組比較均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。3干預措施缺乏有效干預支氣管哮喘導致下氣道重塑改變是引起慢性阻塞性肺病的重要原因,這種重塑改變目前尚缺乏有效的干預策略。而變應性鼻炎同支氣管哮喘有類似的病理過程,因此變應性鼻炎鼻黏膜重塑的機制以及對下呼吸道影響和下呼吸道重塑的相關(guān)性研究成為近年來的研究熱點。3.1鼻灌洗液中ova-sige和ecp含量的檢測IgE介導的變態(tài)反應和EOS致鼻黏膜慢性持續(xù)性炎癥是變應性鼻炎的2個重要特點。EOS活化釋放其細胞內(nèi)的活性顆粒,導致組織炎癥。本研究通過檢測鼻灌洗液中OVA-sIgE、ECP的含量來評價變應性鼻炎豚鼠模型。實驗組和對照組鼻灌洗液中OVA-sIgE的含量組間均差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);同時在實驗組中,同OVA2W組比較,OVA6W和OVA12W組的OVA-sIgE含量呈降低趨勢。與Palmans等在氣道過敏的BN鼠模型中測得的血清OVA-sIgE含量的結(jié)果類似。3.2變應性麻黃性鼻黏膜的基因特征下呼吸道重塑的特征性病理改變?yōu)轲つど掀p傷、支氣管壁增厚、腺體肥大、基膜上膠原沉積、平滑肌數(shù)量和纖維生長因子增加以及氣道高反應性。但鼻黏膜的ECM缺乏平滑肌成分,因此上氣道是否存在類似的重塑現(xiàn)象仍存有爭議。上皮細胞損傷是組織重塑的特點之一。Amin等指出,與健康人相比,變應性鼻炎患者的鼻黏膜上皮有脫落,而同一患者在過敏季節(jié)和非過敏季節(jié)的比較中均有上皮脫落現(xiàn)象。這項研究發(fā)現(xiàn)上皮連接緊密度與EOS聚集程度相關(guān)。本研究對照組鼻黏膜僅有少量纖毛的改變,幾乎無2級以上的上皮損傷;實驗組隨著抗原刺激時間延長,上皮損傷明顯,0級和1級上皮損傷有顯著差異,但2級以上損傷差異無統(tǒng)計學意義。這可能和組織與標本取材、實驗技術(shù)有關(guān)。因此對于長期抗原刺激,上皮損傷是存在的,尤其是1級以上的上皮損傷,基膜暴露,導致EGF、TGF-β1等生長因子激活,從而啟動重塑進程。鼻黏膜腺體主要包括位于基膜的具有單細胞分泌功能的杯狀細胞以及位于固有層的黏液腺。Gluck等的研究結(jié)果表明,花粉癥患者在過敏季節(jié)鼻分泌物涂片中杯狀細胞明顯增多。更多研究也表明變應性鼻炎鼻黏膜腺體除了數(shù)量的變化,其結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化。黏膜重塑另一重要特征是基膜膠原沉積。由于鼻黏膜缺乏平滑肌成分,因此基膜膠原纖維沉積是鼻黏膜重塑研究的焦點。因此本研究用MT染色觀察鼻黏膜基膜以下20μm厚范圍內(nèi)膠原的相對含量。結(jié)果表明,在早期膠原沉積并不明顯,但隨著抗原刺激延長,在6W和12W組,基膜藍染的百分率明顯增加。這一結(jié)果與Braunstahl等報告的變應性鼻炎鼻黏膜基膜下的膠原層增厚結(jié)論相一致。但Sanai等的研究結(jié)果顯示,在變應性鼻炎和非變應性性鼻炎患者的鼻黏膜中膠原總量無明顯差別,但在膠原的組分上卻存在明顯差異,常年變應性鼻炎患者鼻黏膜Ⅰ型和Ⅲ型膠原總量增加,并且鼻黏膜中TGF陽性染色細胞數(shù)量與這種變化有相關(guān)性。TGF-β1參與細胞生長與分化、胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復、炎癥反應調(diào)節(jié)、血管形成、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等多種生理、病理過程。氣道中TGF-β1表達增高,能刺激氣道平滑肌細胞分裂與增殖,導致平滑肌增生和肥厚。因此本研究進一步用免疫組織化學方法檢測與基膜膠原沉積有密切相關(guān)的細胞因子TGF-β1。結(jié)果表明,TGF-β1主要表達在基膜纖維母細胞、上皮細胞、血管和腺體的纖維細胞的細胞質(zhì)和細胞核中。TGF-β1在抗原刺激早期(2w),盡管在宏觀上膠原合成尚未明顯增加,但從微觀上檢測,此時各種生長因子的表達已開始上調(diào),與膠原合成有關(guān)的酶活性已經(jīng)明顯增