gm-csf基因修飾異體腫瘤疫苗誘導(dǎo)cd8+細胞的特異性免疫反應(yīng)

gm-csf基因修飾異體腫瘤疫苗誘導(dǎo)cd8+細胞的特異性免疫反應(yīng)

用腫瘤細胞制備疫苗是腫瘤免疫治療的重要手段，但簡單的腫瘤細胞很難刺激有效的免疫反應(yīng)。聯(lián)合激勵因素、細胞因子和其他基因武器可以增強身體的免疫反應(yīng)。據(jù)研究，骨細胞聚集刺激因子（macrophone）對macrophone具有最強的抑制作用。GM-CSF基因修飾自體腫瘤細胞疫苗已經(jīng)在臨床應(yīng)用,證實該方法可以誘導(dǎo)較強的抗腫瘤免疫活性。但是,自體來源的原代腫瘤細胞的體外培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染等操作都較難控制;而且不同患者來源的細胞在轉(zhuǎn)染效率等方面存在較大差異。因此,利用腫瘤細胞株制備同種異體腫瘤細胞疫苗是很好的替代方法,GM-CSF修飾異體胰腺癌疫苗以及B7基因修飾的肺癌疫苗,在I期臨床試驗中已經(jīng)顯示可以抑制腫瘤生長。但同種異體腫瘤疫苗能否誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng),特別是激活CD8+T細胞,對于探討該類疫苗的作用機制以及臨床應(yīng)用前景具有重要意義。本研究建立小鼠肺癌動物模型,采用異體腫瘤疫苗接種后,分析CD8+T的活化、殺傷活性以及注射部位的浸潤情況,從而評價同種異體腫瘤疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答的機制,為該類型疫苗的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。1材料和方法1.1動物中心動物b實驗用鼠:清潔級近交系C57BL/6(H-2Kb,♀),8～12周齡,體質(zhì)量18～22g,均購自北京維通利華動物中心。小鼠肺癌細胞株LLC及LA795均為本室保存。1.2肺癌細胞株的免疫疫苗利用含小鼠GM-CSF基因的重組質(zhì)粒GM-CSF-pIRES2-EGFP(本室構(gòu)建),以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠肺癌細胞株LA795,并給予致死量(100cGry)的放射照射,制備疫苗。取肺癌細胞株腫瘤疫苗0.1mL懸液(1×106),注射于小鼠左后肢內(nèi)側(cè)皮下,每7天重復(fù)1次,共3次。于接種前和每次免疫后分別取小鼠脾細胞,同時檢測注射部位淋巴細胞浸潤。動物隨機分成3組(PBS組、LA795肺癌細胞瘤苗組、LA795-mGM-CSF肺癌細胞瘤苗組),每組4只。1.3腫瘤細胞接種取Lewis肺癌細胞,用生理鹽水制備細胞懸液,注射于小鼠右后肢內(nèi)側(cè)皮下,每只鼠0.1mL(1×106)。每日觀察腫瘤形成情況。1.4抗體重復(fù)刺激試驗研磨法獲取小鼠脾分離單個核細胞,采用ELISPOT法(B-DPharmingen,ELISPOTMouseIFN-γSet)檢測抗原刺激后細胞活化情況。酶標板包被抗體后,接種細胞(正常對照:1×104cells/well,實驗組:1×106cells/well);實驗組加入照射滅活的LLC細胞作為抗原重復(fù)刺激,正對照孔加入PHA(終質(zhì)量濃度1～4μg/mL),負對照孔加入等體積的無血清培養(yǎng)基;孵育18h。棄去細胞及培養(yǎng)基,加入預(yù)冷的去離子水靜置10min;洗板,加入生物素標記檢測抗體,37℃孵育1h;洗板,加入酶標親和素,37℃孵育1h;洗板,加顯色液,室溫避光靜置15～45min;待斑點形成適合的大小后,以去離子水洗滌,終止顯色過程;室溫靜置10～30min,晾干。將ELISPOT板置于BiosysBioreader4000PRO自動讀板儀內(nèi)計數(shù)。1.5細胞培養(yǎng)和活性化合物的釋放和釋放取小鼠脾分離單個核細胞,分別以脾細胞和通過磁珠法(MiltenyiBiotec,USA)純化的CD8+T細胞作為效應(yīng)細胞,以LLC細胞株作為靶細胞,檢測細胞殺傷活性。將效應(yīng)細胞和靶細胞按效靶比20∶1混合,同時設(shè)最大釋放、自然釋放、體積校正、本底。37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育4～6h,結(jié)束前45min于最大釋放孔及體積校正孔加入細胞裂解液。離心250g,4min。每孔吸出50μL上清轉(zhuǎn)移入另一96孔板,每孔加底物溶液50μL,室溫閉光孵育30min。加入終止液,測定490nm波長處的吸光度,計算殺傷率。1.6產(chǎn)物的回復(fù)突變試驗取疫苗注射部位切片,免疫組化法檢測CD4+和CD8+細胞浸潤情況。組織切片脫蠟、水化后,PBS洗2～3次。加3%H2O2,室溫靜置10min,PBS洗2～3次?？乖迯?fù),PBS洗。滴加正常山羊血清封閉液,室溫20min,甩去多余液體。滴加Ⅰ抗50μL,室溫靜置1h。PBS洗3次,滴加Ⅱ抗40～50μL,37℃1h。PBS洗3次,DAB顯色5～10min。PBS或自來水沖洗,蘇木精復(fù)染2min。脫水、透明、封片、鏡檢。2結(jié)果2.1小鼠細胞浸漬情況為探討局部的免疫反應(yīng),采用免疫組化方法檢測疫苗接種部位淋巴細胞浸潤的情況。結(jié)果GM-CSF基因修飾腫瘤疫苗治療組小鼠注射部位可見淋巴細胞浸潤,且其中以CD8+細胞為主;而對照組小鼠接種部位則無或僅有極少淋巴細胞(圖1)。2.2免疫前后脾細胞對lc的殺毒效果分別于免疫前以及每次疫苗接種后采集小鼠脾細胞,用照射滅活的LLC細胞重復(fù)刺激后,LDH法檢測其對LLC細胞的殺傷活性。結(jié)果GM-CSF分泌性同種異體疫苗3次免疫后脾細胞對LLC的殺傷率為(39.59±2.56)%,明顯高于免疫前的水平以及對照組細胞的殺傷活性(P<0.05)。為進一步監(jiān)測T細胞的反應(yīng),采用分選的CD8+T細胞作為效應(yīng)細胞,同樣可見疫苗接種后殺傷活性的升高。提示同種異體腫瘤疫苗可誘導(dǎo)淋巴細胞特別是CD8+T細胞對肺癌細胞的殺傷活性(圖2)。2.3活化細胞比例照射滅活的GM-CSF修飾LA795細胞免疫后,小鼠脾淋巴細胞經(jīng)LLC抗原刺激后,活化細胞比例分別為(411±59.63)/106,明顯高于免疫前和對照組中活化細胞數(shù)量(P<0.01)。提示GM-CSF分泌性同種異體腫瘤疫苗接種后,可以誘導(dǎo)肺癌相關(guān)抗原特異性淋巴細胞的活化(圖3)。3納米出現(xiàn)c7/bl小鼠接種專、cd8+t細胞后抗體特異性毒力基因檢測能否誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)是該治療方法發(fā)揮抗腫瘤功效的基礎(chǔ);同時,肺癌因其免疫原性低甚至具有免疫抑制作用,是否適于免疫治療尚有爭議。因此,能否刺激特異性免疫反應(yīng)特別是CD8+T細胞的反應(yīng),成為肺癌疫苗臨床應(yīng)用的關(guān)鍵所在。選擇GM-CSF基因修飾腫瘤細胞疫苗,因為這類腫瘤疫苗具有其獨特的優(yōu)勢:一方面,腫瘤細胞可以作為抗原的來源,作為全細胞疫苗可以涵蓋已知和未知的腫瘤相關(guān)抗原,而不需要事先鑒定所有抗原分子;而且相對于單表位疫苗如肽疫苗,更有利于避免因腫瘤細胞抗原表位突變而發(fā)生的免疫逃逸。另一方面,基因修飾后的腫瘤細胞可以分泌GM-CSF,刺激樹突狀細胞(dendriticcell,DC)的增殖、成熟,而DC作為體內(nèi)最為強大的抗原遞呈細胞(AntigenPresentingCell,APC)可以進一步激活CD4+和CD8+T細胞。GM-CSF基因修飾自體腫瘤細胞疫苗已經(jīng)進入I/II期臨床試驗,結(jié)果顯示該方法可以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng),且未觀察到與之相關(guān)的嚴重的不良反應(yīng)。但是自體腫瘤細胞疫苗在制備和質(zhì)量控制等方面存在很多困難,因此人們探索可能的解決辦法。利用同種異體的腫瘤細胞株制備疫苗,在細胞來源、基因轉(zhuǎn)染等方面具有獨特的優(yōu)勢,而且由于細胞株性狀的穩(wěn)定,使得不同批次之間的差異可以得到很好的控制。但異體疫苗發(fā)揮作用的前提是不同來源腫瘤細胞存在共同抗原,而該抗原可以被患者的APC遞呈并誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫反應(yīng),特別是殺傷性T細胞CTL的反應(yīng),因為CTL細胞被認為是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)細胞。因此同種異體腫瘤疫苗能否有效激活CD8+T細胞,并發(fā)揮特異性殺傷活性,對于探討該類疫苗的免疫作用機制及臨床應(yīng)用前景,具有至關(guān)重要的意義。利用接種Lewis肺癌的C57/BL小鼠作為動物模型,GM-CSF基因修飾LA795細胞(組織分型不同)作為同種異體腫瘤疫苗,探討小鼠T細胞免疫反應(yīng)。首先,采用ELISPOT方法檢測小鼠脾細胞的活化情況,GM-CSF分泌性腫瘤疫苗治療后,小鼠脾細胞經(jīng)照射滅活的LLC刺激后,活化細胞數(shù)量明顯高于免疫前以及對照組;其次,腫瘤疫苗接種后小鼠脾細胞以及純化的CD8+T細胞,對Lewis肺癌細胞的殺傷活性明顯提高。即同種異體腫瘤疫苗同樣可以刺激“自體”腫瘤相關(guān)抗原特異性淋巴細胞的活化和殺傷功能,更為重要的是可以誘導(dǎo)CD8+T細胞的殺傷活性升高,而CTL被認為是抗腫瘤免疫的主要力量。另外,疫苗注射部位出現(xiàn)淋巴細胞浸潤,而且以CD8+T細胞為主,也提示淋巴細胞及