基因工程學(xué)概論

基因工程原理GeneticEngineering1編輯ppt高成江，教授，泰山學(xué)者88382292(office),88382113(lab)Office:building6,Rm438Email:cgao@2編輯ppt第一章概論

一、基因工程概述根本概念開展歷史相關(guān)理論的復(fù)習(xí)二、基因工程的根本過程與策略三、基因工程的開展與應(yīng)用3編輯ppt一、根本概念基因工程載體和復(fù)制子DNA重組、轉(zhuǎn)化4編輯ppt基因工程(geneticengineering)：在基因水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法取得特定基因，在體外重組于載體DNA分子上，然后將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖〔稱為“克隆〞〕和行使正常功能〔稱為“表達(dá)〞〕，從而制備人類需要的基因、基因產(chǎn)物或創(chuàng)造出新的生物類型的分子生物學(xué)技術(shù)。5編輯ppt復(fù)制子〔Replicon〕具有獨(dú)立復(fù)制能力的DNA分子，或DNA分子中可從某一起點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制的局部稱復(fù)制子。載體〔Vector〕：能容忍外源DNA片段插入，可在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移并在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的DNA分子。6編輯ppt轉(zhuǎn)化(transformation)：

以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA，在一定條件下引入受體細(xì)胞的過程。DNA重組〔DNArecombination)：

不同來源的DNA片段共價(jià)連接、通過重新組合構(gòu)成了具有兩個(gè)DNA分子遺傳信息的新重組體DNA分子的過程。7編輯ppt基因工程開展歷史基因工程三大理論根底基因工程三大技術(shù)發(fā)現(xiàn)8編輯ppt20世紀(jì)40年代：證明了遺傳物質(zhì)是DNA20世紀(jì)50年代：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)20世紀(jì)60年代：確定了遺傳信息的傳遞方式基因工程理論根底9編輯ppt格里菲思肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)R〔Rough〕型菌：無莢膜，無毒性S〔Smooth〕型菌：有莢膜，有毒性10編輯ppt11編輯pptR型細(xì)菌R型細(xì)菌只長R型菌只長R型菌R型細(xì)菌S型菌的DNAS型菌的蛋白質(zhì)或莢膜多糖S型菌的DNA+DNA酶S型菌R型細(xì)菌艾弗里及同事的實(shí)驗(yàn)

12編輯ppt〔含S〕〔含P〕蛋白質(zhì)

的組成元素：

DNA

的組成元素：C、H、O、N、〔S〕C、H、O、N、P(99%)

——用32p標(biāo)記——用35S標(biāo)記噬菌體13編輯ppt赫爾希和蔡斯得噬菌體侵染細(xì)菌實(shí)驗(yàn)離心離心14編輯pptDNA的空間結(jié)構(gòu)

沃森和克里克根據(jù)對DNA的X光衍射結(jié)果，以及對DNA分子不同堿基之間數(shù)量關(guān)系的分析，提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。從圖上可識別出DNA是由兩條鏈交纏在一起的螺旋結(jié)構(gòu)15編輯ppt面對DNA雙螺旋模型的美國生物學(xué)家沃森(左)和英國生物物理學(xué)家克里克(右)。沃森、克里克發(fā)現(xiàn)生命的雙螺旋而榮獲1962年諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)。16編輯ppt遺傳信息的傳遞方式轉(zhuǎn)錄DNARNA翻譯蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制Non-codingRNAmicroRNA,lncRNA17編輯ppt基因工程學(xué)重大的技術(shù)發(fā)現(xiàn)1970年限制性核酸內(nèi)切酶的別離和純化〔HindIII〕1970年逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)1972年載體與重組技術(shù)1972年Berg首次實(shí)現(xiàn)基因重組1973年Cohen重組DNA轉(zhuǎn)化

基因工程核心技術(shù)：DNA的重組技術(shù)18編輯ppt相關(guān)理論的復(fù)習(xí)基因的概念和特性基因組DNA的結(jié)構(gòu)與性能DNA的復(fù)制DNA的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控19編輯ppt基因的概念和分子生物學(xué)定義遺傳學(xué)概念：位于染色體上的根本遺傳單位，攜帶遺傳信息，控制遺傳性狀分子生物學(xué)定義：編碼功能性蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA分子所必需的全部核酸序列，負(fù)載特定的遺傳信息并在一定條件下表達(dá)遺傳信息，指令或調(diào)控蛋白質(zhì)合成。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)mRNA20編輯ppt21編輯ppt基因的功能分類結(jié)構(gòu)基因〔structuregene)：決定蛋白質(zhì)/多肽鏈或酶分子的結(jié)構(gòu)調(diào)控基因(regulatorygene)：調(diào)節(jié)控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)功能22編輯ppt乳糖操縱子23編輯ppt基因的一般特性半保存自我復(fù)制決定生物表型或性狀基因突變新的生物性狀24編輯ppt基因組〔genome〕概念：細(xì)胞或生物體的全套遺傳物質(zhì)的總和常見基因組特點(diǎn)：病毒基因組原核生物基因組真核生物基因組人類基因組25編輯ppt1.病毒基因組基因組小，基因數(shù)少帶有重疊基因大局部為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因26編輯pptHBV基因組27編輯ppt2.

原核生物基因組基因組很小，大多只有一條染色體〔細(xì)菌染色體〕質(zhì)粒〔plasmid〕：細(xì)菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，是環(huán)狀閉合的雙鏈DNA。可自主復(fù)制編碼生物學(xué)形狀基因工程常用載體結(jié)構(gòu)簡單，沒有核膜存在轉(zhuǎn)錄單元多順反子28編輯ppt

29編輯ppt

30編輯ppt細(xì)菌及質(zhì)粒DNA的三種構(gòu)型：超螺旋：共價(jià)閉環(huán)〔CCC〕開環(huán)：單鏈缺口〔OC〕線型：雙鏈斷裂〔L〕31編輯ppt真核生物基因組真核基因組結(jié)構(gòu)龐大3×109bp、染色質(zhì)、核膜基因不連續(xù)性，大局部基因含有內(nèi)含子(intron)非編碼區(qū)域多于編碼區(qū)域(9:1)，編碼基因約2萬個(gè)單順反子含有大量重復(fù)序列32編輯ppt人類基因組細(xì)胞核基因組〔nucleargenome)線粒體基因組(mitochondrialgenome)33編輯pptDNA的結(jié)構(gòu)根本單位：核苷酸〔A、T、C、G〕雙螺旋結(jié)構(gòu)34編輯pptDNA的性能吸收光譜頂峰為260nm在電場中的遷移率與分子量大小、構(gòu)象有關(guān)DNA變性：在物理或化學(xué)因素作用下，氫鍵斷裂成單鏈的過程DNA復(fù)性：變性因素去除后，恢復(fù)成雙鏈的過程35編輯pptDNA的復(fù)制與表達(dá)半保存復(fù)制〔semi-conservativereplication〕基因表達(dá)〔geneexpression〕轉(zhuǎn)錄DNARNA翻譯蛋白質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制36編輯ppt：解旋酶催化解旋模板〔在DNA聚合酶的催化下，利用游離的脫氧核苷酸進(jìn)行〕復(fù)制：以母鏈為模板進(jìn)行堿基配對母鏈〔舊鏈〕子鏈〔新鏈〕：組成復(fù)制后的DNA同時(shí)進(jìn)行DNA的復(fù)制37編輯ppt復(fù)制子DNA中發(fā)生一次復(fù)制的單位稱為復(fù)制子(replicon)。復(fù)制子是根據(jù)它含有復(fù)制所需的控制元件來定義的，在復(fù)制啟動(dòng)位點(diǎn)具起始點(diǎn)〔origin)，在復(fù)制終止位點(diǎn)具終點(diǎn)〔terminus)。起始點(diǎn)僅作用于所在復(fù)制子。注：在每個(gè)細(xì)胞周期中，每個(gè)復(fù)制子發(fā)生一次復(fù)制，且只發(fā)生一次。38編輯ppt質(zhì)粒一般是一個(gè)自主環(huán)狀的DNA基因組，構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立復(fù)制子；原核生物基因組中一般只含一個(gè)復(fù)制子，在唯一的起始點(diǎn)啟動(dòng)就會(huì)引起整個(gè)基因組復(fù)制；真核生物基因組含多個(gè)復(fù)制子〔一般40-100kb/個(gè)〕。不同生物復(fù)制子的數(shù)目39編輯ppt40編輯ppt基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄：遺傳信息DNARNA模板鏈：反義鏈或〔-〕鏈，dsDNA分子中被轉(zhuǎn)錄成RNA轉(zhuǎn)錄本的鏈編碼鏈：有義鏈或〔+〕鏈，以T代替U，與RNA轉(zhuǎn)錄本具有同樣的序列轉(zhuǎn)錄酶：依賴于DNA的RNA聚合酶把轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的堿基定為+1，5’端方向?yàn)椤?〞，3’端為“+〞啟動(dòng)子與終止子41編輯pptTemplate(-)StrandTranscribestomRNA3’5’5’3’RNAtemplatestrandnontemplatestrand(+)strand(-)strand5’3’codingstrandAUGCodonisdenotedonmRNAATGTACUAGTAGATCStartcodonIdenticalsequence42編輯pptBothDNAStrandsCouldBeExpressed5’3’RNA3’5’DNA3’5’RNA5’3’DNARNAissynthesizedin5’→3’directionAdenovirusfullyutilizesitsgenomicsequencePromotermarkstheinitiationoftranscription43編輯pptXNontemplateAntisenseRNAInhibitstheExpression-++AntisenseRNARNA/RNAHybridmRNATemplate-+-AntisenseGenePromoterRNAi44編輯ppt原核細(xì)胞中基因的表達(dá)調(diào)控主要包括2個(gè)過程：轉(zhuǎn)錄和翻譯轉(zhuǎn)錄：遺傳信息DNARNA

翻譯：mRNA蛋白質(zhì)真核細(xì)胞中基因的表達(dá)調(diào)控是多層次的，包含多個(gè)步驟。45編輯ppt原核生物基因表達(dá)特點(diǎn)僅一種RNA聚合酶，識別原核細(xì)胞啟動(dòng)子，催化所有RNA合成。原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA(nakedDNA)，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進(jìn)行。在翻譯過程中形成多核糖體，每個(gè)核糖體獨(dú)立完成一條肽鏈的合成。46編輯ppt原核生物形成多順反子mRNA：mRNA在合成過程中和多個(gè)核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。47編輯ppt一般不含內(nèi)含子〔intron〕，沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng)原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起，形成操縱子。48編輯ppt操縱子〔operon〕：原核生物基因表達(dá)的根本單位〔即一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位〕。是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的假設(shè)干基因組成的一個(gè)遺傳單位。標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)包括：調(diào)控區(qū)(調(diào)節(jié)基因，啟動(dòng)基因，操縱基因)，位于上游結(jié)構(gòu)基因：3-12個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄終止子：位于下游共同協(xié)調(diào)作用，結(jié)構(gòu)基因被轉(zhuǎn)錄成一個(gè)多順反子mRNA，再翻譯成各自的蛋白質(zhì)。49編輯ppt乳糖操縱子結(jié)構(gòu)Lac操縱子調(diào)控區(qū)有I基因、啟動(dòng)子〔P〕和操縱基因〔O〕，LacI編碼阻遏蛋白，結(jié)合于操縱基因〔O〕上，啟動(dòng)子〔P〕是轉(zhuǎn)錄起始時(shí)RNA酶的結(jié)合部位Lac操縱子有3個(gè)結(jié)構(gòu)基因：Z基因、Y基因和A基因，分別編碼beta-半乳糖苷酶、滲透酶和乙?；?，參與乳糖的代謝。Lac操縱子受分解代謝系統(tǒng)的正調(diào)控和阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控50編輯ppt乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控I基因編碼的阻遏蛋白與操縱基因〔O〕結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)錄；誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，操縱基因解除抑制，RNA聚合酶結(jié)合于啟動(dòng)子，基因轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為同時(shí)含有Z基因、Y基因和A基因的多順反子mRNA51編輯ppt啟動(dòng)子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。一般長40-60bp，富含A-T堿基對共有保守序列：-10區(qū)〔pribnowbox，TATAbox〕：位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游10bp處，TATAAT，與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離5-10bp，是給RNA聚合酶定向的序列，使RNA合成按5′3′方向進(jìn)行-35區(qū)：位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游35bp處，有TTGACA一組共有序列，RNA聚合酶的識別序列52編輯pptRNA聚合酶識別并結(jié)合啟動(dòng)子各種啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄能力不同啟動(dòng)子強(qiáng)弱取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列53編輯ppt-35區(qū)是RNA聚合酶對轉(zhuǎn)錄起始的識別位點(diǎn)，識別結(jié)合后，酶到達(dá)Pribnow盒，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被翻開，形成開放型啟動(dòng)子復(fù)合物，開始轉(zhuǎn)錄54編輯ppt終止子〔terminator，T〕:位于DNA鏈的3’端,給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的序列.特征：

富含G/C的區(qū)域和富含A/T區(qū)域相鄰排列，具有回文對稱結(jié)構(gòu)，在RNA轉(zhuǎn)錄本上形成莖-環(huán)〔stem-loop)結(jié)構(gòu)。

不同的終止子的作用也有強(qiáng)弱之分。包括與蛋白質(zhì)因子無關(guān)的轉(zhuǎn)錄終止信號和依賴于蛋白質(zhì)因子的轉(zhuǎn)錄終止信號55編輯ppt富含GC的反向重復(fù)序列富含AT的序列

轉(zhuǎn)錄形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)

莖-環(huán)結(jié)構(gòu)比轉(zhuǎn)錄泡內(nèi)的RNA-DNA雜合雙鏈穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄泡喪失，RNA聚合酶與模板DNA解離，轉(zhuǎn)錄終止56編輯ppt原核細(xì)胞與翻譯有關(guān)的組分：——核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosomebindingsite,RBS)〔1〕翻譯起始密碼子AUG〔2〕SD順序〔Shine-Dalgarno〕：是細(xì)菌核糖體結(jié)合于mRNA和翻譯起始所必需的核苷酸序列存在于大腸桿菌mRNA的前導(dǎo)序列區(qū)，AUG上游3-11bp長約3-9bp,富含嘌呤核苷酸5′…AGGAGG…3′與16s核糖體RNA3′-端堿基3′…UCCUCC…5′互補(bǔ)，將AUG安置于核糖體適當(dāng)位置，啟動(dòng)翻譯反響1974年澳大利亞的Shine和Dalgarno首先提出57編輯ppt真核生物基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)1、RNA聚合酶2、多層次3、個(gè)體發(fā)育復(fù)雜4、活性染色體結(jié)構(gòu)變化：對核酸酶敏感、DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化、DNA堿基修飾變化、組蛋白變化5、正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)6、轉(zhuǎn)錄與翻譯間隔進(jìn)行7、轉(zhuǎn)錄后修飾、加工58編輯ppt真核基因表達(dá)的調(diào)控模式

(Theregulatingmodelof

eukaryoticgeneexpression)

1、轉(zhuǎn)錄前水平(基因組水平)：genelevel2、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控:transcriptionlevel3、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控:post-transcriptionlevel4、翻譯水平的調(diào)控:translationlevel5、翻譯后修飾:post-translationmodification59編輯ppt1、轉(zhuǎn)錄前水平(基因組水平)：genelevel染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化、穩(wěn)定持久，組蛋白修飾，DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)〔epigenetics〕60編輯ppt2.轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控順式調(diào)控元件(cis-actingelement)

反式作用因子(trans-actingfactor)61編輯ppt〔1〕順式調(diào)控元件(cis-actingelement)結(jié)構(gòu)基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列，主要包括：起正性調(diào)節(jié)作用：啟動(dòng)子、增強(qiáng)子起負(fù)性調(diào)節(jié)作用：寂靜子，終止子，加尾信號62編輯ppt啟動(dòng)子位于基因5’末端與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的核苷酸序列。作用特點(diǎn)是近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定。一般包括核心啟動(dòng)子元件〔corepromoterelements)：指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，決定基因轉(zhuǎn)錄的精確起始位點(diǎn)產(chǎn)生根底水平的轉(zhuǎn)錄，包括：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及-30區(qū)的TATA-box上游啟動(dòng)子元件〔upstreampromoterelements)包括-70到-80bp區(qū)域的CAAT盒及其兩側(cè)的GC盒，協(xié)同決定轉(zhuǎn)錄的根底效率組織特異性元件誘導(dǎo)性啟動(dòng)子元件63編輯ppt真核啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)模式圖核心啟動(dòng)子元件上游啟動(dòng)子元件64編輯ppt

哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子中常見的元件元件名稱共同序列結(jié)合的蛋白因子名稱分子量結(jié)合DNA長度TATAboxTATAAAATBP30,000~10bpGCboxGGGCGGSP-1105,000~20bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,000~22bpOctamerATTTGCATOct-176,000~20bp

Oct-253,000~23bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000~10bpATFGTGACGTAFT?20bp65編輯ppt

增強(qiáng)子(enhancer)是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件增強(qiáng)子要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用，但增強(qiáng)子對啟動(dòng)子沒有嚴(yán)格的專一性無方向性〔序列、位置〕遠(yuǎn)距離作用〔1-4kB〕無基因特異性具組織特異性構(gòu)建載體66編輯ppt寂靜子〔silencer)或衰減子〔attenuator)是一類抑制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子，作用方式與增強(qiáng)子相同轉(zhuǎn)錄終止信號：控制基因轉(zhuǎn)錄的終止，由polyA上游的10-20bp處的加尾信號〔AATAA〕和polyA下游的G/T簇構(gòu)成67編輯ppt〔2〕反式作用因子(trans-actingfactor)

由位于不同或相同染色體上相距較遠(yuǎn)的基因所編碼的蛋白質(zhì)因子，通過與順式調(diào)控元件和RNA聚合酶的相互作用而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。68編輯pptPTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA結(jié)合蛋白〕Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinBDNA69編輯ppt3、轉(zhuǎn)錄后的修飾內(nèi)含子的剪接外顯子的拼接mRNA的加尾和加帽mRNA的穩(wěn)定性70編輯ppt

4、翻譯水平的調(diào)控主要是microRNA對mRNA、tRNA和rRNA的調(diào)控71編輯ppt5、翻譯后的調(diào)控

切除信號肽糖基化乙酰化磷酸化甲基化蛋白質(zhì)的降解72編輯pptII.基因工程的根本過程及研究策略一、目的基因的制備二、載體DNA及其改造三、體外DNA重組四、重組DNA的轉(zhuǎn)化五、重組體的篩選鑒定與克隆擴(kuò)增六、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(dá)73編輯ppt基因工程過程示意圖①從細(xì)胞中別離出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片斷③質(zhì)粒載體的選擇④DNA重組⑤重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因/使其表達(dá)③③74編輯ppt一、目的基因的制備直接別離DNA鳥槍法克隆目的基因構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的基因酶法或化學(xué)方法人工合成基因mRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因差異蛋白質(zhì)普表達(dá)技術(shù)篩選功能基因75編輯ppt適于遺傳背景清楚的細(xì)菌染色體酶切電泳別離DNA探針確定、回收特異性片段〔探針：用同位素或其它非放射物質(zhì)標(biāo)記的一段特定的DNA或RNA片段〕

1．直接別離DNA76編輯ppt2.鳥槍法克隆目的DNA適于DNA背景不清時(shí)將完整基因組〔genome〕的隨機(jī)片段克隆入某種載體的方法。用于建立基因庫或篩選特定基因用限制酶切成許多片斷77編輯ppt適于真核細(xì)胞染色體別離細(xì)胞mRNA

3.構(gòu)建cDNA文庫，篩選目的基因cDNA建立cDNA文庫克隆擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄78編輯ppt4.人工合成DNADNA聚合酶鏈反響〔PCR〕—DNA體外擴(kuò)增技術(shù)

DNA化學(xué)合成儀DNA合成儀PCR擴(kuò)增儀79編輯ppt二、載體DNA及其改造80編輯ppt1.作為載體的條件：

具備控制自我復(fù)制的位點(diǎn)

有多種酶的單一酶切位點(diǎn)〔多克隆位點(diǎn)〕

存在易于檢測的表型標(biāo)志

分子量小，多拷貝

攜帶幅度寬

非自我轉(zhuǎn)移〔平安〕81編輯ppt82編輯ppt2.常用載體質(zhì)?！睵lasmid〕病毒載體〔SV40,AdV)噬菌體〔λPhage〕83編輯ppt３.質(zhì)粒載體復(fù)制類型及特點(diǎn)〔1〕嚴(yán)緊型質(zhì)粒〔Stringentplasmid)質(zhì)粒的復(fù)制受宿主菌的嚴(yán)格控制拷貝數(shù)低〔１～５copy/cell〕具有自身傳遞能力〔2〕松弛型質(zhì)?！睷elaxedplasmid〕質(zhì)粒復(fù)制與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成無關(guān)拷貝數(shù)高〔10～200copy/cell〕(加氯霉素可使拷貝數(shù)達(dá)1000倍)小分子量，不能自動(dòng)傳遞84編輯ppt4.載體的分類

克隆載體：克隆擴(kuò)增，如pBR322

表達(dá)載體：復(fù)制、表達(dá)，如pcDNA3,pVAX---帶有基因表達(dá)各種元件的載體,使攜帶的外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)；

---真核表達(dá)載體和原核表達(dá)載體85編輯ppt原核表達(dá)載體：

適用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。主要元件：強(qiáng)啟動(dòng)子

SD順序篩選標(biāo)志其它調(diào)控基因86編輯ppt融合型載體----pGEX系列Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---Xa因子位相載體87編輯ppt真核表達(dá)載體：

適用于在真核細(xì)胞〔哺乳動(dòng)物細(xì)胞〕中表達(dá)外源基因的載體。主要元件：1〕強(qiáng)啟動(dòng)子2〕增強(qiáng)子3〕篩選標(biāo)記：胸苷激酶(tk)基因、二氫葉酸復(fù)原酶(dhfr)基因、新霉素抗性基因4〕轉(zhuǎn)錄終止信號和多聚腺苷酸信號5〕復(fù)制元件：6〕原核細(xì)胞的局部序列88編輯ppt89編輯ppt三、體外DNA重組概念：

不同來源的DNA片段共價(jià)連接、通過重新組合構(gòu)成了具有兩個(gè)DNA分子遺傳信息的新重組體DNA分子的過程。分類：粘末端連接同聚物核苷酸末端法平末端連接法人工接頭連接T-A克隆90編輯ppt1.粘末端連接粘性末端〔cohesiveendsorstickends〕：dsDNA分子經(jīng)酶切割后所產(chǎn)生的限制性片段的單股末端含3’或5’突出。同一酶切所形成的粘末端，互補(bǔ)堿基相互配對而結(jié)合。91編輯ppt

92編輯ppt2.同聚物核苷酸末端法DNA或RNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶在DNA片段3′末端制備粘末端。防止自身環(huán)化互補(bǔ)序列較長時(shí)〔>4bp)，不需連接酶93編輯ppt

94編輯ppt3.平末端連接：不含3’或5’突出優(yōu)點(diǎn)：可連接任何一對DNA

可恢復(fù)一個(gè)酶切位點(diǎn)或產(chǎn)生一個(gè)新酶切位點(diǎn)缺點(diǎn)：連接率低要求連接酶及底物濃度高95編輯ppt4.T-A克隆96編輯ppt四、重組DNA的轉(zhuǎn)化97編輯ppt1.根本概念轉(zhuǎn)化〔transformation〕：把以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA，在一定條件下引入受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)染〔transfection〕：以噬菌體或病毒構(gòu)建的重組DNA引入受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)化子：又稱工程菌，即接受了重組DNA的受體菌。98編輯ppt2.受體細(xì)胞及感受態(tài)感受態(tài)：細(xì)胞最易攝取和“容忍〞外來DNA的生理狀態(tài)。致敏：誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作。感受態(tài)細(xì)胞的特點(diǎn)：接受DNA的位點(diǎn)暴露；膜通透性增加；修飾酶活性最高，限制酶活性最低受體細(xì)胞處于非增殖階段99編輯ppt３．轉(zhuǎn)化方法1〕氯化鈣轉(zhuǎn)化法2〕電轉(zhuǎn)化法100編輯ppt4.轉(zhuǎn)化規(guī)律載體分子愈小，轉(zhuǎn)化率越高環(huán)狀DNA分子較線型DNA分子轉(zhuǎn)化率高1000倍新鮮制備的〔對數(shù)生長的〕幼嫩細(xì)胞轉(zhuǎn)化易成功。101編輯ppt五、重組體篩選、鑒定與克隆擴(kuò)增102編輯ppt1.常用篩選/鑒定陽性重組體的方法平板篩選插入失活插入表達(dá)電泳篩選PCR篩選核酸雜交DNA測序免疫學(xué)檢測法初步篩選精確鑒定103編輯ppt1.平板篩選法〔1〕插入失活〔insertionalinactivation)：在載體的基因編碼序列中，當(dāng)某個(gè)限制性內(nèi)切酶作用位點(diǎn)上插入外源DNA后，其活性失去，不能表達(dá)相應(yīng)的功能。常以此現(xiàn)象作為標(biāo)記，篩選被這種重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。104編輯ppt105編輯ppt106編輯ppt結(jié)果分析：1.AmpsTets〔轉(zhuǎn)化失敗〕2.AmprTetr〔轉(zhuǎn)化成功，但無重組〕3.AmprTets〔重組、轉(zhuǎn)化均成功〕107編輯pptH2NCOOH

-galactosidaseOntheplasmidOnthechromosome(DH5α,TOP10)藍(lán)白斑選擇：LacZ108編輯pptE.coliengineeredforBlue/WhiteScreening(DH5α,TOP10)chromosome

-gal

-galMCSNonfunctionalNonfunctional-Complementation109編輯ppt110編輯ppt111編輯pptIPTG+beta-gal112編輯ppt113編輯ppt〔2〕插入表達(dá)〔insertionalexpression)載體設(shè)計(jì)時(shí)，篩選標(biāo)志基因前連接一段負(fù)控制序列〔抑制〕，當(dāng)目的DNA插入該點(diǎn)使其抑制作用失活時(shí)，其下游篩選標(biāo)志才能表達(dá)。114編輯pptCI為負(fù)控制序列〔抑制Ter表達(dá)〕，DNA插入CI失活,Tet表達(dá)。115編輯ppt2.電泳法篩選別離轉(zhuǎn)化菌質(zhì)粒，酶切電泳，根據(jù)DNA分子大小不同，鑒別真正重組體DNA，排除假陽性〔如載體自我連接載體雙重體〕該法不能鑒別插入片段大小相似的非目的基因片段的假陽性。

116編輯ppt

聯(lián)合酶切鑒定同源末端連接重組子中

DNA插入片段的方向117編輯ppt3.菌落原位雜交〔HybridizationinSitu〕鑒別陽性重組體時(shí)，用與目的DNA互補(bǔ)的探針測定陽性菌落。處理轉(zhuǎn)化菌，使DNA從由內(nèi)釋放，以探針測定。118編輯ppt菌落原位雜交法篩選復(fù)印至硝酸纖維素膜上用NaOH菌體裂解DNA變性雜交放射自顯影32P-cDNA與放射性cDNA雜交的菌落的斑點(diǎn)細(xì)菌菌落單鏈DNA結(jié)合到膜上119編輯ppt4.免疫學(xué)檢測法依據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合反響的原理，以單克隆抗體對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行特異性檢測。120編輯ppt121編輯ppt

經(jīng)上述方法篩選、鑒定的陽性重組子菌落克隆擴(kuò)增表達(dá)功能性蛋白產(chǎn)物獲得大量拷貝的DNA片段制備探針等122編輯ppt六、目的DNA在受體細(xì)胞中的表達(dá)123編輯ppt

基因工程表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌系統(tǒng)枯草桿菌系統(tǒng)酵母細(xì)胞系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)124編輯pptⅢ基因工程的開展及應(yīng)用

125編輯ppt別離了第一個(gè)RE(HindⅢ)1972EcoRⅠ酶切SV40DNA與λDNA后重組首次實(shí)現(xiàn)體外重組1973年首次完成了克隆轉(zhuǎn)化〔重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli〕1973年—1977人工測序1978：生產(chǎn)了第一個(gè)GE產(chǎn)品1980：建立了第一個(gè)GE生產(chǎn)工廠1985：PCR技術(shù)問世1989NIH方案、出臺人類基因組方案2000.6：人類基因組草圖一、基因工程進(jìn)展

126編輯ppt二、基因工程應(yīng)用基因工程疫苗與DNA疫苗、嵌合抗體基因治療基因工程藥物研究基因功能127編輯ppt基因工程疫苗與DNA疫苗?；蚬こ桃呙纭睪eneticEngineeringVaccine，GEV〕以基因重組技術(shù)表達(dá)的重組蛋白作為疫苗。DNA疫苗/核酸疫苗〔Nucleicacidvaccine，NAV〕直接導(dǎo)入帶有目的DNA的表達(dá)載體

重組病毒載體疫苗〔recombinantviralvectorvaccine，RVVV〕

128編輯ppt

Human-mousechimericAb129編輯ppt基因治療已進(jìn)入理性化的正常軌道三個(gè)關(guān)鍵問題：

高效的、靶向性基因?qū)胂到y(tǒng)，外源基因表達(dá)的可控性篩選有治療價(jià)值的基因130編輯ppt基因工程藥物基因重組藥物植物基因工程藥物動(dòng)物基因工程藥物131編輯ppt胰島素原的人工合成

胰臟(A)n胰島素原mRNAcDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌mRNA反轉(zhuǎn)錄酶胰島素原基因與質(zhì)粒連接感染E.coli胰島素原132編輯ppt研究基因功能基因的表達(dá)調(diào)控基因產(chǎn)物的相互作用基因產(chǎn)物的定位基因產(chǎn)物的功能133編輯ppt舉例：1、研究基因的表達(dá)調(diào)控134編輯pptInflammasome135編輯ppt克隆NLRP3啟動(dòng)子并做截?cái)嗤蛔凅w136編輯ppt137編輯ppt舉例：2、研究基因的功能138編輯ppt1MQIFVKTLTGKTITLEVEPS21DTIENVKAKIQDKEGIPPDQ

41QRLIFAGKQLEDGRTLSDYN61IQKESTLHLVLRLRGGUbiquitin139編輯ppt140編輯pptTheubiquitination-proteasomedegradationpathway141編輯ppt原核表達(dá)載體142編輯ppt143編輯ppt表達(dá)載體構(gòu)建144編輯ppt表達(dá)載體酶切鑒定145編輯ppt序列測定146編輯ppt原核細(xì)胞表達(dá)147編輯ppt體外泛素化及WB檢測148編輯ppt舉例：3、蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位發(fā)光基因〔GFP，RFP〕免疫熒光149編輯ppt150編輯ppt151編輯pptTRIM38localizesinaggresome152編輯pptTLR-inducedhnRNPUnucleartocytoplasmictranslocation153編輯ppt舉例：4、Co-immunoprecipitation(IP)研究蛋白與蛋白的相互作用第一個(gè)蛋白的抗體pull-down蛋白復(fù)合物，利用第二個(gè)蛋白質(zhì)的抗體做WB，如果可檢測到第二個(gè)蛋白，就證明第一個(gè)蛋白可與第二個(gè)蛋白相互作用。154編輯pptTRIM38interactswithTRAF6throughPRY/SPRY

155編輯ppt舉例：5、酵母雙雜交系統(tǒng)156編輯ppt