生物分析中溶血對檢測的影響及其對策

生物分析中溶血對檢測的影響及其對策［摘要］液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)敏捷度高，選擇性強(qiáng)，是現(xiàn)在體內(nèi)藥品分析的首選辦法，但LC-MS/MS生物分析中仍面臨著溶血樣品測定失敗的難題。溶血造成的樣品測定數(shù)據(jù)不精確，將直接影響藥品的藥動學(xué)研究，如何進(jìn)行溶血樣品的測定已成為各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)和全球生物分析行業(yè)探討的重點(diǎn)。本文從溶血樣品產(chǎn)生的因素進(jìn)行分析，將溶血對檢測的影響和作用方式以及溶血效應(yīng)的考察辦法進(jìn)行了概述，最后對溶血樣品的測定辦法和方略進(jìn)行探討。［核心詞］溶血；生物分析；串聯(lián)質(zhì)譜；色譜法，高壓液相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)是將分離能力強(qiáng)的液相色譜與能夠提供構(gòu)造信息的串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合在一起，含有敏捷度高、選擇性強(qiáng)的特點(diǎn)。LC-MS/MS技術(shù)的應(yīng)用，可獲得豐富、有效的化合物構(gòu)造信息，建立快速、高效的分析研究體系，現(xiàn)在已成為體內(nèi)藥品分析的首選辦法。體內(nèi)藥品分析的樣品普通為人血漿或血清樣品，涉及被測樣品少，樣品復(fù)雜及干擾物質(zhì)多等問題，在實(shí)際測定工作中，采集的血漿或血清樣品常出現(xiàn)溶血的現(xiàn)象。一項(xiàng)針對歐洲分析協(xié)會的調(diào)查顯示溶血為辦法學(xué)驗(yàn)證失敗的因素之一，現(xiàn)在也有不少文獻(xiàn)報(bào)道了溶血樣品測定失敗的案例，溶血樣品測定過程中面臨著溶血樣品響應(yīng)低、樣品穩(wěn)定性差以及基質(zhì)效應(yīng)等問題，造成阿托伐他汀、去氧腎上腺素、氟伏沙明等藥品的檢測失敗?？梢?，溶血對測定的影響成為體內(nèi)藥品分析領(lǐng)域中亟待解決的難題，同時(shí)也受到了各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛關(guān)注。中國藥典《生物樣品定量分析指導(dǎo)原則》指出“除正?；|(zhì)外，還應(yīng)關(guān)注其它樣品的基質(zhì)效應(yīng)，例如溶血或高血脂的血漿樣品等”。歐洲藥品管理局（EMA）同樣規(guī)定考察溶血樣品的基質(zhì)效應(yīng)。而巴西國家衛(wèi)生監(jiān)督局（ANVISA）的規(guī)定則更加明確，基質(zhì)效應(yīng)需分析八個(gè)不同來源的樣品，涉及4個(gè)正常血漿樣品、2個(gè)脂血樣品以及2個(gè)溶血樣品。與此同時(shí)，美國政府在近年的白皮書中也多次討論溶血樣品的測定問題。然而各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)的規(guī)定都相對含糊，缺少明確的做法和原則，因此溶血樣品的檢測仍面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，廣大研究者應(yīng)引發(fā)重視。本文結(jié)合溶血樣品測定現(xiàn)狀，對溶血樣品測定失敗問題進(jìn)行全方面分析和總結(jié)，并探討了溶血測定失敗的解決方案，從而確保生物分析成果的精確性。溶血樣品的產(chǎn)生溶血是指紅細(xì)胞破裂，血紅蛋白逸出釋放到血漿或血清中。一項(xiàng)針對18項(xiàng)臨床生物等效性（bioequivalency，BE）實(shí)驗(yàn)的10640個(gè)樣品的調(diào)查顯示，溶血樣品為211個(gè)，占樣品總量的1.98%。溶血會造成血漿或血清顏色和密度的變化，溶血血漿根據(jù)溶血程度不同顏色呈粉紅色或紅色；溶血的血漿中血紅蛋白、膽紅素、磷脂等生理成分增加，血漿的密度發(fā)生變化。據(jù)報(bào)道，溶血的血漿中血紅蛋白的含量不不大于200μg·mL-1，遠(yuǎn)不不大于非溶血血漿中血紅蛋白的量。溶血可發(fā)生在體內(nèi)和體外，造成溶血的因素也十分復(fù)雜。溶血的發(fā)生可能是患者疾病狀態(tài)、生理狀況等體內(nèi)因素造成的；也可能是抽血所用針頭太小、抽血速度過快、過分震蕩以及離心時(shí)轉(zhuǎn)速過快等體外因素造成的；轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存過程不當(dāng)也會造成溶血。其中，體外因素是造成溶血的重要因素。臨床實(shí)驗(yàn)的血漿或血清樣品普通是在不同時(shí)間點(diǎn)采集的，涉及周期長，影響因素多，溶血樣品的產(chǎn)生很難避免，因此研究人員需提前做好人員培訓(xùn)，親密關(guān)注血樣采集的全過程，減少采集、離心、凍存及轉(zhuǎn)移任一環(huán)節(jié)可能發(fā)生的溶血。溶血對測定的影響溶血血漿或血清中許多生理成分明顯增加，如血紅蛋白、膽紅素、磷脂等，這些成分可能會影響溶血樣品中藥品的檢測?，F(xiàn)在，許多文獻(xiàn)就溶血樣品檢測失敗的問題進(jìn)行了有關(guān)報(bào)道。HUGHES等采用LC-MS/MS技術(shù)測定血漿中卡維地洛及其代謝物的濃度，原型藥品卡維地洛可精確測定，而代謝物4-羥基卡維地洛和5-羥基卡維地洛測得的濃度明顯減少，只有理論濃度的0.2%；測定奧氮平時(shí)，溶血樣品較正常血漿樣品出現(xiàn)明顯的離子克制現(xiàn)象，奧氮平和內(nèi)標(biāo)奧氮平-d3的響應(yīng)減少約500倍，造成奧氮平和內(nèi)標(biāo)均無法測定；而阿托伐他汀的溶血樣品內(nèi)標(biāo)附近會出現(xiàn)明顯的干擾峰，影響阿托伐他汀低濃度樣品的定量。BERUBE等的研究表明，溶血樣品中的血紅蛋白會造成嗎啡的氧化和降解。文獻(xiàn)中CARTER等在進(jìn)行沙丁胺醇辦法驗(yàn)證時(shí)，發(fā)現(xiàn)可精擬定量1%和2%溶血的血漿樣品，無法精擬定量5%溶血的血漿樣品（1%溶血指血漿樣品中破碎的紅細(xì)胞的比率為1%，V/V）?？梢娙苎獙λ幤窚y定的影響是廣泛存在的，研究表明溶血還會影響血漿中腎上腺素、氟伏沙明、水楊酸、阿塞那平等藥品的LC-MS/MS分析。通過以上研究發(fā)現(xiàn)，溶血可使目的分析物的響應(yīng)下降，實(shí)測濃度偏低，溶血對藥品測定的影響程度根據(jù)藥品的性質(zhì)及溶血程度的差別而不同，而溶血影響檢測的作用方式也會根據(jù)藥品性質(zhì)的差別而不同。下列總結(jié)了幾個(gè)溶血影響藥品的LC-MS/MS分析的常見方式：（1）影響藥品的穩(wěn)定性，紅細(xì)胞破裂釋放的酶可能造成藥品在溶血血漿中不穩(wěn)定，研究表明激素、維生素、嗎啡等在溶血血漿中穩(wěn)定性受到影響；（2）影響與紅細(xì)胞有高親和力的藥品，使測定濃度比實(shí)際濃度偏高，藥品濃度可高數(shù)百倍，如輕微的溶血現(xiàn)象可使甲醋唑胺的濃度明顯提高；（3）影響血漿結(jié)合率高的藥品，細(xì)胞內(nèi)液造成藥品稀釋，測定濃度比實(shí)際濃度偏低；（4）溶血使細(xì)胞生理成分增加，造成離子克制或增強(qiáng)，基質(zhì)效應(yīng)明顯，影響目的分析物的測定。因此，我們將基質(zhì)中所含破碎紅細(xì)胞對分析物定量的影響，統(tǒng)稱為溶血效應(yīng)。紅細(xì)胞破碎造成的基質(zhì)效應(yīng)是溶血效應(yīng)最重要的體現(xiàn)方式，也是基質(zhì)效應(yīng)的一種特殊形式。同時(shí)，溶血效應(yīng)也可體現(xiàn)在影響藥品穩(wěn)定性和響應(yīng)等方面。溶血效應(yīng)可能使藥品檢測的精確度、精密度不符合規(guī)定，最后造成研究數(shù)據(jù)被回絕。特別是對于cmax和末端點(diǎn)，可能造成的濃度偏移或藥品濃度-時(shí)間曲線點(diǎn)的缺失，均會嚴(yán)重影響藥品藥動學(xué)研究的數(shù)據(jù)計(jì)算，造成臨床研究成果不完整。因此，LC-MS/MS生物分析中應(yīng)特別關(guān)注溶血樣品的測定，在辦法驗(yàn)證中應(yīng)考察溶血效應(yīng)。溶血效應(yīng)的考察在辦法驗(yàn)證過程中，應(yīng)進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)，考察溶血效應(yīng)。普通可分為三步，首先考察目的分析物在溶血基質(zhì)中與否穩(wěn)定，與否需要更低的存儲溫度或添加穩(wěn)定劑；另首先進(jìn)行溶血樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察，擬定基質(zhì)效應(yīng)的大??；最后進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)，考察溶血質(zhì)控樣品的精密度、精確度和重現(xiàn)性。藥品在溶血基質(zhì)中與否穩(wěn)定，應(yīng)首先進(jìn)行考察。若藥品在溶血基質(zhì)中不能保持穩(wěn)定，則檢測得到的數(shù)據(jù)不能反映實(shí)驗(yàn)中藥品的真實(shí)濃度。研究者應(yīng)考慮造成藥品不穩(wěn)定的因素，若為紅細(xì)胞破裂釋放的酶造成藥品的不穩(wěn)定的狀況，可考慮添加酶克制劑或其它穩(wěn)定劑；若為溶血基質(zhì)儲存溫度不當(dāng)，也可考慮減少儲存溫度，從-20℃降到-80℃。該研究狀況也應(yīng)及時(shí)告知臨床研究中心和生物分析實(shí)驗(yàn)室，確保樣品采集和存儲過程中的穩(wěn)定性。另首先，研究者應(yīng)關(guān)注溶血造成的基質(zhì)效應(yīng)。溶血樣品的基質(zhì)效應(yīng)可能是紅細(xì)胞破碎釋放的內(nèi)源性的物質(zhì)如鹽、脂質(zhì)、磷脂等引發(fā)的。如何進(jìn)行溶血樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察成為探討的重點(diǎn)。普通通過向血漿中添加不同比例的紅細(xì)胞破裂的全血來模擬溶血基質(zhì)，溶血基質(zhì)的制備辦法因?qū)嶒?yàn)室而異。有的實(shí)驗(yàn)室通過重復(fù)凍融破裂紅細(xì)胞；有的通過機(jī)械震蕩的方式破碎紅細(xì)胞；尚有通過在-20℃或-70℃冷凍數(shù)小時(shí)的方式破碎全血中的紅細(xì)胞。然后將目的分析物在溶血基質(zhì)中的響應(yīng)與非溶血基質(zhì)或工作液的響應(yīng)進(jìn)行比較，進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)因子的計(jì)算。除關(guān)注溶血造成的基質(zhì)效應(yīng)，還應(yīng)關(guān)注溶血造成的其它問題，如干擾藥品測定的雜質(zhì)峰的出現(xiàn)，影響藥品響應(yīng)等，研究者能夠通過溶血實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。溶血實(shí)驗(yàn)即通過配制目的分析物溶血和非溶血質(zhì)控（qualitycontrol，QC）樣品，前解決后進(jìn)樣分析，比較其在溶血樣品與非溶血樣品中響應(yīng)或濃度的差別，考察溶血效應(yīng)。鑒于不不大于2%溶血的生物樣品（即基質(zhì)含破碎紅細(xì)胞的量不不大于2%）是極少見的，建議溶血實(shí)驗(yàn)中考察2%溶血的樣品即可。研究者可分別配制2%溶血和非溶血的低高濃度QC樣品（n=6），前解決后進(jìn)樣分析，溶血實(shí)驗(yàn)的接受原則為每濃度組內(nèi)的變異系數(shù)（coefficientofvariation，CV）在15%以內(nèi)，且溶血樣品與非溶血樣品的平均響應(yīng)或濃度差別在15%之內(nèi)。若開發(fā)的辦法無法通過溶血實(shí)驗(yàn)，可考慮溶血基質(zhì)和目的分析物與否充足孵育；也可減少溶血程度后再次進(jìn)行溶血實(shí)驗(yàn)；同時(shí)分析實(shí)際樣品中溶血樣品的數(shù)量及所處藥品濃度-時(shí)間曲線的位置，評定重新開發(fā)辦法的必要性或統(tǒng)計(jì)分析中不納入受溶血影響的數(shù)據(jù)。溶血樣品測定的建議1溶血樣品的判斷建立一種對溶血不“敏感”的LC-MS/MS檢測辦法，完畢辦法學(xué)的驗(yàn)證是進(jìn)行溶血樣品檢測的前提條件，而在實(shí)際樣品的測定過程中，第一步需完畢溶血樣品的鑒別和判斷。一項(xiàng)研究表明，有74%的研究者通過視覺直觀判斷，將溶血樣品與非溶血樣品進(jìn)行分辨；20%通過比色卡進(jìn)行判斷，其它的通過臨床儀器進(jìn)行分辨。然而，視覺分析含有一定的主觀性且無法將2%及更高程度的溶血樣品分辨，比色卡尚未有統(tǒng)一的原則，儀器檢測過于繁瑣，溶血樣品的判斷面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。研究者可通過制備溶血樣品，繪制本實(shí)驗(yàn)室的溶血比色卡，建立溶血樣品判斷的原則操作規(guī)程，使溶血樣品的判斷規(guī)范化和精確化，并根據(jù)樣品的溶血程度進(jìn)行下一步的檢測。若測定過程中出現(xiàn)溶血程度遠(yuǎn)高于辦法驗(yàn)證中考察的溶血水平，研究者可將溶血程度高的樣品以正常血漿稀釋后再進(jìn)行測定，減少溶血效應(yīng)。2優(yōu)化分析條件在檢測過程中碰到溶血樣品檢測失敗，還可通過優(yōu)化LC-MS/MS辦法，增加敏捷度，減少溶血效應(yīng)。根據(jù)藥品的構(gòu)造、解離常數(shù)和極性大小，選擇適宜的色譜條件和質(zhì)譜條件。2.1優(yōu)化色譜條件通過改善色譜分離，避免待測物和基質(zhì)成分一同出峰，經(jīng)常能夠有效地消除基質(zhì)效應(yīng)。在阿托伐他汀的檢測中，HUGHES等通過調(diào)節(jié)流動相中有機(jī)相和水相的比例，將溶血樣品中的干擾峰和內(nèi)標(biāo)物分開。改善色譜分析條件，適宜地延長待測組分的保存時(shí)間，也有助于減少基質(zhì)對測定的影響，MATUSZEWSKI等在分析人血漿中的非那雄胺時(shí)通過增加待測物的保存時(shí)間，從而成功地使待測物與基質(zhì)分離開來。梯度洗脫是LC-MS/MS分析中最慣用的洗脫方式，梯度洗脫通過逐步變化流動相的洗脫強(qiáng)度，使各組分能較好地被先后洗脫出來。同時(shí)，不同的色譜柱分離效果不同，對基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生不同的影響，選擇適合類型的色譜柱對樣品分析至關(guān)重要。2.2優(yōu)化質(zhì)譜條件研究者通過優(yōu)化質(zhì)譜調(diào)節(jié)，選擇適宜的離子源及質(zhì)譜參數(shù)，有助于提高敏捷度，避免基質(zhì)效應(yīng)。LC-MS/MS慣用的離子源涉及大氣壓光噴霧電離源（APPI）、大氣壓化學(xué)電離源（APCI）、電噴霧電離源（ESI），不同的電離方式對基質(zhì)效應(yīng)的影響不同，這3種離子源克服基質(zhì)效應(yīng)的能力依次為：APPI＞APCI＞ESI，但并不意味者全部的樣品都應(yīng)選擇基質(zhì)效應(yīng)小的離子源，鹵米松、辛伐他汀等在ACPI模式下的響應(yīng)則不如ESI。研究者應(yīng)綜合多方面的考慮因素，選擇適宜的離子源。同時(shí)，變化質(zhì)譜裂解參數(shù)也有助于消除基質(zhì)效應(yīng)。2.3優(yōu)化樣品前解決過程在檢測過程中碰到溶血樣品檢測失敗，可通過優(yōu)化樣品前解決過程，盡量去除血漿中的生理性成分，減少溶血效應(yīng)。可優(yōu)先選擇固相萃?。⊿PE）和液液萃?。↙LE）進(jìn)行前解決，獲得更干凈的樣品；對于使用蛋白沉淀辦法解決的樣品，敏捷度高可稀釋后再進(jìn)樣分析；可直接減少前解決中基質(zhì)的體積。文獻(xiàn)中采用SPE解決卡維地洛后，無法精擬定量溶血樣品中卡維地洛代謝物，樣品解決后萃取物顏色異常，提示血紅蛋白或膽紅素被一起提取出來，因此在SPE解決前先進(jìn)行蛋白沉淀，盡量去除溶血釋放的血紅蛋白等，并在SPE解決中多添加一步酸洗，去除殘留的溶血成分。通過優(yōu)化前解決過程，使溶血樣品中的目的分析物卡維地洛可被精擬定量分析。2.4使用同位素內(nèi)標(biāo)建議使用同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)。文獻(xiàn)中測定去氧腎上腺素時(shí)，采用構(gòu)造類似物α-（甲氨甲基）苯甲醇作為內(nèi)標(biāo)，去氧腎上腺素的溶血實(shí)驗(yàn)成果顯示高低濃度的去氧腎上腺素溶血QC樣品與非溶血QC樣品間的差別均超出了15%，而更換為同位素內(nèi)標(biāo)去氧腎上腺素-d3后可滿足測定規(guī)定。α-（甲氨甲基）苯甲醇與去氧腎上腺素構(gòu)造只有一種羥基的差別，但其作為內(nèi)標(biāo)與同位素內(nèi)標(biāo)的實(shí)驗(yàn)成果卻截然不同，這種差別可能是目的分析物去氧腎上腺素和成果類似物內(nèi)標(biāo)α-（甲氨甲基）苯甲醇在溶血基質(zhì)中的回收率不一致造成的，這種現(xiàn)象提示研究者在分析過程中采用構(gòu)造類似物作為內(nèi)標(biāo)是存在一定風(fēng)險(xiǎn)的。同時(shí)，WU等的研究也表明選用同位素內(nèi)標(biāo)可獲得更加好的測定成果。由于同位素內(nèi)標(biāo)與目的分析物的構(gòu)造性質(zhì)一致，可修正分析物和內(nèi)標(biāo)因基質(zhì)中回收率的差別而對成果帶來的影響。同時(shí)，中國藥典《生物樣品定量分析指導(dǎo)原則》也指出“當(dāng)在生物分析辦法中使用質(zhì)譜檢測時(shí)，推薦盡量使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)”。2.5溶血樣品的實(shí)驗(yàn)樣品再分析（incurredsamplereanalysis，ISR）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)樣品再分析是采用LC辦法進(jìn)行生物體內(nèi)藥品分析的重要環(huán)節(jié)，由于生物基質(zhì)的復(fù)雜性，藥用輔料的多樣性和實(shí)驗(yàn)樣本的特異性，ISR是評定分析辦法固有缺點(diǎn)的核心指標(biāo)之一?，F(xiàn)在，F(xiàn)DA、EMA及中國藥典《生物樣品定量分析指導(dǎo)原則》均建議進(jìn)行ISR實(shí)驗(yàn)，由于在辦法驗(yàn)證中使用的校正標(biāo)樣和QC樣品可能無法模擬實(shí)際實(shí)驗(yàn)樣品，例如，蛋白結(jié)合、已知和未知代謝物的回復(fù)轉(zhuǎn)化、樣品均一性或同服藥品引發(fā)的差別。研究者可通過在不同時(shí)間后，用已驗(yàn)證的辦法在另外一種分析批次中重新分析實(shí)驗(yàn)樣品，并與第一次分析成果進(jìn)行比較，來評價(jià)實(shí)際樣品測定的精確度。而對于溶血樣品，基質(zhì)更為復(fù)雜，包含紅細(xì)胞破碎釋放的鹽、脂質(zhì)、磷脂和酶類，辦法驗(yàn)證中的QC樣品能否模擬實(shí)際樣品更有待考察。因此建議研究者在ISR實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)選擇一定比例的溶血樣品，評價(jià)溶血樣品分析的重現(xiàn)性，確保研究成果的真實(shí)可信。結(jié)語溶血