濁點(diǎn)萃取-高效液相色譜法測(cè)定牛奶中三聚氰胺

濁點(diǎn)萃取-高效液相色譜法測(cè)定牛奶中三聚氰胺

云萃取是一種新型的液相萃取技術(shù)。根據(jù)表面活性劑束溶液的溶解度特性和云沉淀現(xiàn)象，通過(guò)改變溫度和濕度等操作條件，導(dǎo)致相分離，并將親水材料與親水性材料分離。該方法不僅避免了大量揮發(fā)性有機(jī)溶劑的使用,并且表面活性劑用量小,體系組成簡(jiǎn)單,條件溫和,易于操作,具有經(jīng)濟(jì)、安全、高效、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于金屬離子、蛋白質(zhì)的分離、天然藥物活性成分的提取及土壤和水中農(nóng)藥殘留的分析。三聚氰胺簡(jiǎn)稱(chēng)三胺,又稱(chēng)蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺,是一種三嗪類(lèi)含氮雜環(huán)有機(jī)化合物。三聚氰胺的檢測(cè)方法主要有:苦味酸法、升華法、電位滴定法、重量法,以及酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒法、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、毛細(xì)管電泳以及近紅外檢測(cè)法等。本文選用非離子表面活性劑(TritonX-100)為破乳試劑,非離子表面活性劑(PEG600)為萃取劑,對(duì)牛奶中三聚氰胺的濁點(diǎn)萃取行為進(jìn)行研究,為建立三聚氰胺快速檢測(cè)技術(shù)提供有效手段。1實(shí)驗(yàn)部分1.1hh-s16s俄Waters單泵液相色譜儀:515泵,紫外可見(jiàn)檢測(cè)器,HederaODS-2-C18色譜柱(250mm×4.6mm);離心機(jī)(6000r/min);HH-S26S數(shù)顯恒溫水浴鍋。三聚氰胺(純度不小于98.5%,成都市科龍化工試劑廠),配成100mg/L的儲(chǔ)備液;PEG600配成300g/L的水溶液,TritonX-100配成200g/L的水溶液;Na2SO4、Na2CO3、檸檬酸均為分析純;乙腈和庚烷磺酸鈉均為色譜純;離子對(duì)試劑緩沖溶液(取2.10g檸檬酸、2.02g庚烷磺酸鈉配制,定容至1L,pH3.0);三氯乙酸(分析純,南京化學(xué)試劑廠)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1u3000酸、堿分別加熱在刻度試管中加入5g(精確至0.01g)牛奶,再分別加入TritonX-100和CCl3COOH,使其終質(zhì)量濃度均為20g/L,混勻,在100℃水浴中加熱10min,然后以6000r/min離心10min。移出上清液并用蒸餾水洗滌,合并清液,用蒸餾水定容至10mL。取樣液5.0mL,分別加入PEG600、Na2SO4和Na2CO3,使其終質(zhì)量濃度分別為130、260、5g/L,70℃水浴中平衡30min,使其分層,移走水相。1.2.2流動(dòng)相密度的影響采用C18反相色譜柱,以離子對(duì)試劑緩沖液和乙腈為流動(dòng)相(體積比為9∶1),以0.8mL/min的流速,定量進(jìn)20μL的膠束樣(0.25μm微孔纖維膜過(guò)濾),在240nm波長(zhǎng)下進(jìn)行分析。2結(jié)果與討論2.1破乳劑條件優(yōu)化2.1.1氯乙酸質(zhì)量濃度對(duì)破乳效果的影響分別使用鹽酸、磷酸、三氯乙酸、醋酸對(duì)牛奶進(jìn)行破乳,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),三氯乙酸的破乳速度最快。考察了不同質(zhì)量濃度(5~60g/L)的三氯乙酸對(duì)破乳的影響。實(shí)驗(yàn)表明,三氯乙酸的質(zhì)量濃度大于20g/L時(shí),破乳速度以及破乳程度均比較理想,實(shí)驗(yàn)選用20g/L三氯乙酸。三氯乙酸破乳的同時(shí),能夠給三聚氰胺提供酸性環(huán)境,使其很好地溶解在清液中,減少因破乳而引起的目標(biāo)檢測(cè)物的損失。2.1.2tri能力的影響加入酸的同時(shí)加入無(wú)機(jī)鹽,可以加快牛奶的破乳速度并提高破乳的程度,但會(huì)使牛奶中的乳脂顆粒絮凝于清液上部,給清液的完全取出帶來(lái)困難,而采用TritonX-100代替無(wú)機(jī)鹽時(shí),乳脂顆粒的絮凝速度快于未加TritonX-100或加鹽時(shí)的速度,且離心后乳脂顆粒沉積于清液底部,分離效果較為明顯?？疾炝薚ritonX-100的濃度對(duì)破乳的影響,實(shí)驗(yàn)表明,TritonX-100的質(zhì)量濃度低于20g/L時(shí),仍有部分乳脂顆粒絮凝于清液上部,質(zhì)量濃度大于20g/L時(shí),絮凝物完全沉積于清液底部,但隨著TritonX-100濃度的增大,牛奶樣品的處理液有一定的粘度,且使樣液帶有一定的泡沫,給樣品的分離帶來(lái)困難。綜上,選取TritonX-100的濃度為20g/L。2.1.3in破乳熱反應(yīng)時(shí)間對(duì)破乳效果的影響考察了加熱溫度(50~100℃)、加熱時(shí)間(5~20min)對(duì)破乳效果的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),加熱溫度高于80℃時(shí)即可破乳,加熱溫度越高,破乳速度越快,破乳效果越理想,實(shí)驗(yàn)選用100℃水浴。100℃水浴加熱10min,即達(dá)到完全破乳。2.2優(yōu)化廢點(diǎn)提取條件2.2.1膠束相及質(zhì)量濃度考察了表面活性劑Tween-20、Tween-60、PEG600、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000對(duì)回收率的影響(見(jiàn)圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Tween-20、Tween-60、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000的膠束相均過(guò)于粘稠,不能直接進(jìn)樣,且回收率均低于60%。只有PEG600既能夠?qū)崿F(xiàn)相的分離,又能獲得最大回收率,且由于其粘度很低,便于進(jìn)行液相色譜分析,因此選用PEG600。對(duì)PEG600的質(zhì)量濃度(50~160g/L)進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量濃度達(dá)到130g/L時(shí),回收率最大,隨后再增加PEG600質(zhì)量濃度對(duì)回收率的影響不大。因此選擇PEG600的質(zhì)量濃度為130g/L。2.2.2so4和na2co3鹽能夠加快相分離。考察了Na2SO4和Na2CO3兩種鹽對(duì)濁點(diǎn)萃取的影響,結(jié)果表明,單獨(dú)加入Na2CO3時(shí),隨著Na2CO3的用量增大,目標(biāo)檢測(cè)物回收率雖有增加,但共萃物亦增多,且有一雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰難分離,而用Na2SO4代替Na2CO3時(shí),能夠克服上述缺點(diǎn)。而加入Na2SO4的同時(shí)加入少量Na2CO3,可使萃取過(guò)程在弱堿性環(huán)境下進(jìn)行,回收率大于單獨(dú)使用Na2SO4時(shí)的回收率。同時(shí)考察了不同質(zhì)量濃度的Na2SO4(100~280g/L)和Na2CO3(0~10g/L)對(duì)回收率的影響,實(shí)驗(yàn)表明,隨著Na2SO4用量的增大,回收率亦增大,當(dāng)Na2SO4的質(zhì)量濃度達(dá)到260g/L時(shí),回收率最大,再增大Na2SO4的用量對(duì)回收率的影響不大;隨著Na2CO3用量的增大,回收率亦增大,但當(dāng)Na2CO3的質(zhì)量濃度大于5g/L時(shí),共萃物增多,且出現(xiàn)了與目標(biāo)峰難分離的雜質(zhì)峰。實(shí)驗(yàn)中所用的Na2SO4和Na2CO3的質(zhì)量濃度分別為260g/L和5g/L。2.2.3溫度和時(shí)間對(duì)濁點(diǎn)萃取的影響考察了平衡溫度(50~100℃)和平衡時(shí)間(10~60min)對(duì)濁點(diǎn)萃取的影響,結(jié)果表明,在70℃水浴中平衡30min,回收率最大。溫度過(guò)高,膠束相中共萃物增多;平衡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)回收率無(wú)顯著影響。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限按照實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)三聚氰胺的定量范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明被測(cè)物的質(zhì)量濃度為0.4~80mg/L時(shí)具有良好的線性關(guān)系, 其回歸方程為y=431841x+6924.40(y表示峰面積;x表示樣品的質(zhì)量濃度,單位為mg/L),相關(guān)系數(shù)r=0.9998,以信噪比為3確定檢出限為0.9mg/kg。在樣品中分別添加3種質(zhì)量濃度的三聚氰胺,計(jì)算添加回收率,結(jié)