藥品清潔殘留分析方法有關(guān)概念及影響因素

正文對于大多數(shù)藥廠而言，共線生產(chǎn)的情況比較普遍，因此，《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GoodManufacturingPractice，GMP）規(guī)定藥品生產(chǎn)管理和質(zhì)量控制的基本要求是最大限度地降低藥品生產(chǎn)過程中污染、交叉污染以及混淆、差錯等的風(fēng)險[1]。生產(chǎn)后對設(shè)備的清潔作為防止污染和交叉污染的有效措施，需要用清潔驗證來證實清潔方法的有效性。清潔驗證歷來是藥品生產(chǎn)檢查的重點，從近年的國際國內(nèi)檢查來看，也發(fā)現(xiàn)了不少問題，許多企業(yè)在清潔殘留限度標(biāo)準(zhǔn)、部分設(shè)備未開展清潔驗證、清潔方法和取樣方法與回收率等多個方面存在不同程度的問題[2]。本文以清潔殘留分析方法回收率的研究為切入點，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對比歸納殘留物分析方法的有關(guān)概念和做法，研究影響分析方法回收率的各種因素。1相關(guān)概念對清潔后殘留物分析方法的方法學(xué)考察，特別是對回收率的考察，關(guān)系到清潔是否徹底、清潔方法是否有效、清潔驗證是否成功的關(guān)鍵。本文結(jié)合有關(guān)專著、文獻(xiàn)的描述，GMP及有關(guān)附錄中的規(guī)定，對涉及清潔驗證分析方法的3組概念分別進(jìn)行分析。其中2個回收率的概念關(guān)系本文主旨觀點，筆者通過對法規(guī)描述的分析提出自己的觀點——將2個概念“合二為一”統(tǒng)一為“分析方法回收率”。筆者認(rèn)為，之所以有2個不同的回收率概念，是因為對殘留限度與可接受標(biāo)準(zhǔn)2個概念混淆不清，所以本文對這2個概念進(jìn)行了分析，為提出統(tǒng)一的分析方法回收率概念提供支持。第3組概念“清潔對象與清潔參照物”是分析方法的目標(biāo)物，關(guān)系到分析方法的準(zhǔn)確性即回收率研究的必要性，筆者結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)的描述對此一并進(jìn)行了分析比較。1.1取樣方法回收率與檢驗方法回收率清潔驗證中有2個回收率的概念，一為檢驗方法回收率，一為取樣方法回收率?！端幤飞a(chǎn)驗證指南》[3]中就有“方法的回收率可與取樣的回收率結(jié)合進(jìn)行”“取樣回收率和檢驗方法回收率在內(nèi)的綜合回收率一般不低于50%”的描述。GMP[1]中對回收率的概念也有明確的要求，例如第一百四十三條“清潔驗證應(yīng)當(dāng)綜合考慮設(shè)備使用情況、所使用的清潔劑和消毒劑、取樣方法和位置以及相應(yīng)的回收率、殘留物的性質(zhì)和限度、殘留物檢驗方法的靈敏度等因素”；GMP原料藥附錄[4]第二十四條“應(yīng)當(dāng)確定分析方法可達(dá)到的回收率?！保ㄔ纤幐戒浿械姆治龇椒礄z驗方法。本文將分析方法與檢驗方法區(qū)分開。詳見下文）。對檢驗方法來說，回收率表示測定的結(jié)果與真實值或參比值接近的程度，即準(zhǔn)確度[5]；同理，對取樣方法來說，回收率就是取樣方法“取下來”的量與實際添加量接近的程度。對清潔驗證時清潔殘留的分析，一般認(rèn)為檢驗方法回收率要先于取樣方法回收率，因為取下來的量的多少要用一個可靠的檢驗方法來檢測。檢驗方法通過驗證后，方可進(jìn)一步確定取樣方法。得到取樣方法回收率后，以殘留限度與取樣方法回收率的乘積作為可接受標(biāo)準(zhǔn)（在GMP[1]中，未明確殘留限度與可接受標(biāo)準(zhǔn)的具體含義。本文將這兩個概念區(qū)分開。詳見下文），用來判斷當(dāng)前清潔方法對設(shè)備生產(chǎn)后的清潔是否有效。1.2殘留限度與可接受標(biāo)準(zhǔn)GMP確認(rèn)與驗證附錄[6]第八章清潔驗證中有殘留限度和可接受標(biāo)準(zhǔn)2個不同的概念，但未進(jìn)一步說明。筆者認(rèn)為殘留限度應(yīng)是經(jīng)過評估分析計算得出的，清潔后允許殘留在設(shè)備表面，對下批產(chǎn)品的生產(chǎn)不會造成安全性影響的最大值（單位面積下）；可接受標(biāo)準(zhǔn)是因為取樣方法的局限性，即取樣方法回收率，在實際取樣后用來確定設(shè)備是否達(dá)到清潔標(biāo)準(zhǔn)的值。殘留限度與可接受標(biāo)準(zhǔn)的區(qū)別，即上文所述的“殘留限度×取樣方法回收率=可接受標(biāo)準(zhǔn)”。因此，只有將殘留限度和可接受標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分開來，對取樣回收率的研究才有意義；只有將取樣方法回收率的結(jié)果計算進(jìn)去，才能反映真實的殘留情況[7]。這也正是單純研究檢驗方法回收率不完善的問題所在。1.3清潔對象與清潔參照物

GMP原料藥附錄[4]中有清潔對象和清潔參照物2個不同的概念，但未進(jìn)一步說明。筆者認(rèn)為，清潔對象是幾個共線生產(chǎn)品種經(jīng)過評估分析后，選定的活性或毒性較大的、溶解度較小的、相對更難清潔的產(chǎn)品；而清潔參照物則是清潔的主要對象，是清潔對象中的活性成分。對于原料藥來說，清潔對象與清潔參照物在概念上是等價的，均是該原料藥；對于制劑，則清潔對象是該制劑品種，而清潔參照物則是該品種所使用的原料藥。在筆者查閱的文獻(xiàn)中，絕大多數(shù)的研究者在模擬取樣時使用清潔參照物為樣品。例如王波等[8]在對復(fù)方氯唑沙宗片清潔后的擦拭回收率驗證時，將復(fù)方中的氯唑沙宗和對乙酰氨基酚都作為清潔參照物，均求得了擦拭回收率（分別是72.9%和93.5%）；只有柴振平等[9]和魏巍等[10]將清潔對象作為模擬取樣時的試驗樣品。筆者認(rèn)為，相比于原料藥的清潔，制劑中所含的輔料是否影響活性成分的清潔效果，甚至是否影響清潔后擦拭取樣的效果，這是值得探討的。2文獻(xiàn)分析通過對在中國知網(wǎng)檢索到的2015-2020年的關(guān)于清潔驗證殘留物分析方法的21篇文獻(xiàn)進(jìn)行對比研究，發(fā)現(xiàn)主要分為3種情況：一是僅針對檢驗方法的回收率進(jìn)行研究，未提及取樣方法的回收率，共有2篇[11-12]；二是僅針對取樣方法的回收率進(jìn)行研究，未提及檢驗方法的回收率，共有14篇[8-10,13-23]；三是對2個回收率同時進(jìn)行研究，共有5篇[24-28]。下面對以上3種情況進(jìn)行具體分析。2.1針對檢驗方法回收率進(jìn)行的研究清潔驗證檢驗方法的檢測對象是生產(chǎn)后的清潔殘留，從供試液濃度來說，相當(dāng)于藥品的雜質(zhì)測定。雜質(zhì)測定分兩種情況，即定量分析和限度分析。其中，限度分析在方法驗證時不需要對準(zhǔn)確度即回收率試驗進(jìn)行考察[5]，但從清潔驗證檢驗方法的研究來看，所有的研究者都是按照定量分析的驗證要求來做的，不僅做了回收率試驗，連同精密度、線性和范圍等指標(biāo)也一同進(jìn)行了考察。在清潔驗證回收率的研究中，只針對檢驗方法回收率進(jìn)行研究的文獻(xiàn)較少，僅有2篇文獻(xiàn)。洪麗萍等[11]用HPLC對非諾貝特緩釋片生產(chǎn)清潔后的殘留物非諾貝特進(jìn)行了檢驗方法回收率研究；文中計算得出非諾貝特的殘留限度是0.059μg·cm-2，雖然文中提到模擬取樣的面積為100cm2，但未對取樣方法的回收率研究情況進(jìn)行介紹。蔡亞蘭等[12]用HPLC對硝酸益康唑乳膏生產(chǎn)清潔后的殘留物硝酸益康唑進(jìn)行了檢驗方法回收率研究；文中計算得出硝酸益康唑的殘留限度是2.248μg·cm-2，雖然提到擦拭溶劑為乙醇，但同樣未開展取樣方法回收率的研究，直接設(shè)定取樣回收率為100%。上述研究均是將相應(yīng)生產(chǎn)品種的對照品溶液按照殘留限度的要求稀釋至相應(yīng)濃度，再加入到相應(yīng)濃度級別的對照品溶液中，作為供試品溶液，進(jìn)行加樣回收率試驗。雖然參考藥典“分析方法驗證指導(dǎo)原則”[5]對檢驗方法的其他指標(biāo)一并進(jìn)行了驗證，但由于未對模擬取樣過程進(jìn)行研究或介紹，從清潔驗證角度來說，未按GMP要求考慮取樣方法的回收率，即清潔驗證不充分。2.2針對取樣方法回收率進(jìn)行的研究在整個清潔驗證回收率的研究中，只針對取樣方法回收率進(jìn)行研究的文獻(xiàn)占2/3。涉及的產(chǎn)品類型有片劑、注射液、栓劑、乳膏劑、原料藥及中間體等。檢驗方法絕大多數(shù)是HPLC，少數(shù)采用UV[13-14]，還有以pH和電導(dǎo)率為檢測指標(biāo)[15]。另外，總有機(jī)碳（TOC）也在清潔驗證中有廣泛應(yīng)用，但因其是一種非專屬性檢驗方法，本文未予討論。取樣方法回收率受取樣的具體方法、取樣人員的操作、取樣工具的適用性等因素的影響。取樣過程實際上是對藥簽、溶劑的選擇，以及對取樣人員的操作、殘留物轉(zhuǎn)移到藥簽、樣品溶出（萃取）過程的全面考察[29]。以下主要以擦拭法為例，分析模擬取樣的整個過程中各因素對取樣方法回收率的影響。2.2.1取樣的操作方法取樣時絕大多數(shù)采用擦拭法，部分研究同時結(jié)合了淋洗法[15-17]，也有單獨使用淋洗法[13]的。采用擦拭法，主要是因為能夠?qū)η鍧嵑笕匀徽掣接谠O(shè)備表面的殘留進(jìn)行直接取樣，與淋洗法相比更能反映設(shè)備的清潔狀態(tài)。而淋洗法能夠接觸到不易直接擦拭的設(shè)備內(nèi)表面，可作為擦拭法的補(bǔ)充方法。筆者認(rèn)為，具體的取樣方法不僅與設(shè)備型式有關(guān)（例如很長的管道），也與清潔前生產(chǎn)產(chǎn)品的性質(zhì)、狀況以及生產(chǎn)條件等因素有關(guān)。以一中間儲罐或反應(yīng)釜為例，清潔前生產(chǎn)的產(chǎn)品狀態(tài)為液體，生產(chǎn)條件較為溫和，如果是立即清潔，則完全可以采用淋洗法取樣；反之，對直接接觸產(chǎn)品的零部件或模具較多的復(fù)雜設(shè)備而言，如果生產(chǎn)產(chǎn)品為固體顆粒，甚至是黏性較大的浸膏，則擦拭法是更為可取的取樣方法。2.2.2模擬取樣平面的材質(zhì)由于絕大多數(shù)的生產(chǎn)設(shè)備是不銹鋼材質(zhì)，所以擦拭法使用的材質(zhì)基本上也是不銹鋼的。有研究者對不同的設(shè)備材質(zhì)分別進(jìn)行了取樣方法回收率的研究。賀佩蘭[17]對搪瓷和不銹鋼2種材質(zhì)的平面進(jìn)行了擦拭和淋洗回收率的研究，發(fā)現(xiàn)搪瓷的回收率要高于不銹鋼；張振等[18]則對4種不同材質(zhì)（包括不銹鋼、有機(jī)玻璃、鋼化玻璃、聚四氟乙烯）平面的擦拭取樣方法回收率進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示有機(jī)玻璃最低，不銹鋼最高；境外對我國企業(yè)的檢查也曾提及密封膠圈的材質(zhì)需要進(jìn)行取樣回收率驗證[2]。因此，清潔驗證時要綜合考慮產(chǎn)品在生產(chǎn)中接觸到的各種材質(zhì)，特別是容易處于清潔盲點的設(shè)備閥門、附屬管道和零部件等。2.2.3驗證溶液的量與試驗次數(shù)若選取的各生產(chǎn)設(shè)備各取樣位置經(jīng)擦拭后制得供試液中活性成分的量小于可接受標(biāo)準(zhǔn)（不是殘留限度），說明使用的清潔方法對設(shè)備或設(shè)備鏈?zhǔn)怯行У摹Ｈ臃椒ɑ厥章试囼灂r，向模擬平面上添加的驗證溶液的量應(yīng)該就是殘留限度的量。實際研究中，驗證溶液的量一共有2種方式：一是只有一種數(shù)值；二是圍繞殘留限度有3個不同梯度的量，將殘留限度包括在這個梯度范圍內(nèi)（中間梯度即是殘留限度）。從2017-2018年的國內(nèi)檢查來看，就有諸如“取樣回收率驗證溶液濃度不在可接受范圍內(nèi)”[2]的問題。如同檢驗方法回收率試驗一樣，取樣方法回收率也要多次試驗。但多數(shù)研究者未采用藥典檢驗方法回收率的設(shè)計方式。無論驗證溶液的量如何設(shè)定，取樣方法回收率的試驗次數(shù)和方式多種多樣，有的只進(jìn)行1組試驗，試驗次數(shù)有3[19]、6[20]、9[21]次的；有的設(shè)計3組試驗，每組有3[9-10,13,16-18]、6[22-23]次的。因此，總的試驗次數(shù)相差較大，從3次到18次都有。但筆者考慮，如果上述2種方式（1×6，3×3），與藥典“分析方法驗證指導(dǎo)原則”[5]中對回收率試驗的次數(shù)要求是相同的，既可以同一濃度測定6次，也可以3種不同濃度分別測定3次。2.2.4具體操作過程（涂布、干燥、擦拭與轉(zhuǎn)溶）1）模擬取樣面積、驗證溶液的體積與涂布方式所查文獻(xiàn)中模擬取樣的面積基本分為2種情況，一種是10×10cm2，一種是5×5cm2。各研究者沒有對此作出說明，筆者認(rèn)為取樣面積應(yīng)與實際生產(chǎn)設(shè)備的體量有關(guān)，大型生產(chǎn)設(shè)備的取樣面積宜取較大值，這樣比較有代表性。另外，還與驗證溶液的體積有關(guān)，如果取樣面積大而驗證溶液體積小，溶液在整個平面上分布不均勻。有的文獻(xiàn)[9,18,22-23]中溶液體積很小，僅為0.1mL，如何精確地將如此少量的溶液均勻地涂布在相對較大的面積上，操作起來相對比較困難。對于溶液如何在取樣平面上均勻地分布，各研究者都沒有詳細(xì)描述，均以一種涂布方法簡略而過，有的是“涂”[10,16,19-20]，有的是“滴”[18,22-23]或“點”[9]，有的是“注”[21]，有的是“傾倒”[17]。筆者建議可以采取下列方法：以5×5cm2的取樣面積，驗證溶液體積1mL為例，1mL在常溫下約為20滴（每cm2約1滴），可用矩陣點加法，使用定量移液槍逐滴點到平板上，利用液滴的重力和在平面的張力自然攤開。2）驗證溶液的干燥方式溶液干燥后才能取樣。干燥方式有自然晾（風(fēng)/揮）干[9,14,18,21,23]、電吹風(fēng)吹干[20,22]和烘干[19]。筆者認(rèn)為，采用何種干燥方式應(yīng)與實際清潔后設(shè)備的干燥方式有關(guān)。若設(shè)備清潔后沒有干燥操作的，可選自然晾干；若采用壓縮空氣吹干的，可選電吹風(fēng)吹干（注意風(fēng)速）；加熱或利用余熱干燥的，可用烘干。此外，干燥方式與取樣方法回收率也有一定關(guān)系，不同程度的干燥方式使殘留物質(zhì)與設(shè)備表面產(chǎn)生不同的接合力，殘留物質(zhì)在清潔后仍然粘附于設(shè)備表面，如果擦拭力度不夠，取樣回收率將受影響。這從2015~2018年境外檢查和監(jiān)管機(jī)構(gòu)對我國企業(yè)發(fā)現(xiàn)的問題——“擦拭測定中樣品干燥條件與實際工藝中干燥條件的一致性”[2]的描述上也可以看出。3）擦拭工具、擦拭溶劑和擦拭的時機(jī)和方式擦拭工具多是棉簽，少數(shù)采用了脫脂棉[22-23]或無紡棉[10]。大多數(shù)使用1支棉簽即擦拭1塊取樣平面，有的則使用了2支棉簽或棉團(tuán)[14,18-19,22-23]，甚至3支棉簽[17]。使用棉簽的數(shù)量與平面面積、驗證溶液的量以及棉簽的吸附量等有關(guān)。擦拭的溶劑多種多樣，均是根據(jù)殘留物的溶解性質(zhì)而定。但筆者關(guān)注的不是擦拭溶劑的種類，而是用量。文獻(xiàn)描述多是擦拭工具吸附溶劑后，再擠去多余溶劑，因為溶劑多了反而在擦拭時使已經(jīng)溶解了殘留物質(zhì)的溶劑脫離棉團(tuán)仍然殘留在平面上，造成回收率偏低；反之，溶劑少了，不能充分溶解殘留物質(zhì)，回收率還是偏低。與沒有關(guān)注擦拭溶劑的實際用量一樣，研究者同樣沒有關(guān)注擦拭操作的時機(jī)。清潔后的設(shè)備并不會接著安排后續(xù)生產(chǎn)，GMP規(guī)定清潔驗證時也要考慮設(shè)備清潔后保存時限的影響，因此驗證溶液在平面上干燥后，不宜立即擦拭取樣，特別是產(chǎn)品穩(wěn)定性差或者同步驗證微生物殘留時。筆者建議在清潔驗證時應(yīng)至少在模擬取樣時，從驗證溶液干燥到實際擦拭的時間要滿足清潔規(guī)程中對設(shè)備清潔后保存時限的要求。擦拭法一般是在取樣平面的縱橫2個方向來回蛇形曲線擦拭，使擦拭工具與整個取樣面充分接觸。有的研究者為了提高回收率，在以上操作的基礎(chǔ)上，又增加了2個相互垂直的對角線方向[18]。另外，擦拭時也應(yīng)注意力度和速度，因為力度大了，溶劑容易被擠出；速度快了，溶劑與殘留接觸時間短，也達(dá)不到取樣目的。4）轉(zhuǎn)溶制成供試液擦拭取樣完畢后，需要將擦拭工具上的殘留物質(zhì)用稀釋溶劑溶解，制成最終的供試液。這里有2個問題值得考慮：一是擦拭工具上吸附的擦拭溶劑的量在制備供試液時，對稀釋溶劑的體積有無影響，即供試液的體積是否精確；二是若擦拭溶劑與稀釋溶劑不同，擦拭后再轉(zhuǎn)溶制成供試液時是否考慮互溶性問題，是否會發(fā)生乳化現(xiàn)象。例如，徐興亞等[16]在對乳化機(jī)的清潔驗證時，以氯仿為擦拭溶劑，而在制備供試液時以甲醇為稀釋溶劑；賀佩蘭[17]在研究中以四氫呋喃為擦拭溶劑，在制備供試液時以甲醇水溶液為稀釋溶劑。2.2.5取樣人員基于取樣人員對取樣方法回收率的影響，多數(shù)研究都是基于1名取樣人員的操作，以排除不同操作人員在操作差異，特別是擦拭操作時不同的力度、速度等的影響。但是，考慮到取樣操作多人參與的實際以及不同人員對取樣方法回收率的影響和效果的重現(xiàn)，建議定期對不同取樣人員的取樣方法回收率重現(xiàn)性的操作進(jìn)行確認(rèn)?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)按照不同人員的回收率計算或者按照最低回收率執(zhí)行。以上所述的模擬取樣的結(jié)果（即取樣方法回收率）用以計算可接受標(biāo)準(zhǔn)，實際取樣的結(jié)果用以與可接受標(biāo)準(zhǔn)比較來判定清潔方法的有效性（即清潔驗證的結(jié)論）。因此，無論是模擬取樣還是實際取樣，筆者不建議由生產(chǎn)部門，特別是清潔人員來取樣，而應(yīng)由質(zhì)量保證部門的人員擔(dān)任為宜，以避免既是運動員，又是裁判員的矛盾。清潔由生產(chǎn)人員來做，取樣由QA人員來做，在出現(xiàn)異常時也有助于調(diào)查。例如清潔驗證時3次實際擦拭取樣的結(jié)果相互之間相差較大，而模擬取樣時的RSD較小時，則說明清潔方法的規(guī)定缺乏可操作性或清潔的操作缺少重現(xiàn)性。

2.2.6取樣方法回收率的RSD由于取樣方法回收率的標(biāo)準(zhǔn)相對較低（回收率＞50%，RSD＞20%[3]），各研究結(jié)果均符合以上標(biāo)準(zhǔn)。雖然各研究者都計算了平均值，但在最終計算可接受標(biāo)準(zhǔn)時，不是取平均值，應(yīng)是取最小值。相對于取樣方法回收率的最低限度要求，筆者認(rèn)為其RSD的大小更為重要。RSD大，說明擦拭取樣操作重現(xiàn)性差，回收率的數(shù)值不準(zhǔn)確，不能準(zhǔn)確反映殘留情況。由最終得到的最小值計算出來的可接受標(biāo)準(zhǔn)也僅是清潔驗證的最差條件之一。因此，要研究回收率，就要從以上“2.2.4”分析的具體操作過程入手，提高操作的重現(xiàn)性，盡量減小RSD。這樣得出的可接受標(biāo)準(zhǔn)能反映殘留的真實情況，使實際擦拭結(jié)果是否符合可接受標(biāo)準(zhǔn)的判斷更為準(zhǔn)確。2.3同時對檢驗方法回收率和取樣方法回收率進(jìn)行的研究2.3.1檢驗方法回收率與“1.3”同理，在包括只針對檢驗方法回收率的2篇在內(nèi)的7篇文獻(xiàn)中，只有1篇向?qū)φ掌啡芤褐屑尤胂鄳?yīng)的空白混合輔料[24]，即以模擬清潔對象制備檢驗方法回收率試驗的供試液。其他6篇[11-12,25-28]均是對清潔參照物進(jìn)行了檢驗方法回收率試驗。這6篇文獻(xiàn)中，除2篇的研究對象是原料藥[27-28]，其他4篇的研究對象均是制劑，從藥典對檢驗方法回收率的驗證要求[5]來看，這4篇的研究對象是值得商榷的，沒有考慮輔料可能帶來的影響。建議充分考慮輔料對活性成分擦拭回收的影響，并進(jìn)行充分的風(fēng)險評估，根據(jù)評估的結(jié)果決定是用清潔對象還是清潔參照物來制備檢驗方法回收率試驗的供試液。2.3.2取樣方法回收率取樣方法回收率試驗同樣與“2.2”中介紹的基本相同。不過有的操作步驟和結(jié)果值得注意，例如聶微等[24]在涂布驗證溶液時，將濃度為6.013μg·mL-1的溶液8mL一并“灑”在1塊不銹鋼板劃分的面積相同的2組各8塊區(qū)域上，對如何確保驗證溶液在16塊區(qū)域上均勻分布未做詳細(xì)介紹。馮笑紅等[26]在進(jìn)行擦拭時，除了常規(guī)的縱橫2個方向蛇形曲線擦拭以外，還增加了從平面中心開始螺旋曲線擦拭。石誠[27]對枸櫞酸西地那非生產(chǎn)清潔后進(jìn)行了3個人的擦拭回收率的研究，每人進(jìn)行3次操作，平均回收率是98.63%，RSD=0.33%；而同時做的檢驗方法回收率是99.95%，RSD=0.09%，2個回收率的相對偏差＜1%，可見取樣過程中幾無樣品損失，包括人員對取樣操作幾無影響。為避免擦拭溶劑造成對設(shè)備的二次污染，徐子航[26]在進(jìn)行擦拭時棉簽不用溶劑潤濕。2.3.32個回收率的差異從全部文獻(xiàn)來看，清潔殘留的分析屬于微量或痕量分析，根據(jù)藥典“分析方法驗證指導(dǎo)原則”中樣品中待測成分含量和回收率限度的關(guān)系，含量越低，回收率限度的范圍越寬松[5]。但從以上文獻(xiàn)來看，檢驗方法的回收率均在98%~100%間，準(zhǔn)確度很高，原因即在于多數(shù)研究的供試品不是清潔對象，而是清潔參照物，沒有考慮輔料等因素的影響，檢驗方法回收率相對較高。雖然個別研究表明取樣方法回收率較為一致，但不同的取樣人員對最終結(jié)果的影響還是最大的，因此聶微等[24]認(rèn)為在更換取樣人員后，應(yīng)對取樣方法回收率重新驗證。3討論3.1回收率的概念由前述分析，筆者認(rèn)為，單純對檢驗方法回收率的研究是有待商榷的。之所以會有2個不同的回收率概念，應(yīng)該是對“方法”特別是“方法研究對象”的理解不同。檢驗方法是附屬于取樣方法的（檢驗方法回收率是包含在取樣方法回收率中的），前述的檢驗方法回收率的研究先于取樣方法回收率的作法值得探討。對此，筆者從3個方面進(jìn)行說明：第一，以上觀點出現(xiàn)了概念性的問題，準(zhǔn)確性高的檢驗方法（即藥典和GMP的“分析方法”）研究對象是藥品，這是藥品安全性、有效性和質(zhì)量可控性的本質(zhì)要求；但是本文所述的清潔驗證的檢驗方法，其研究對象不是藥品，而是藥品的殘留。第二，考慮角度不同。即便清潔驗證檢驗方法回收率的研究對象是藥品殘留，多數(shù)研究者的研究對象也是殘留限度級別的活性成分溶液，而非真正意義上的清潔對象。這是由于僅從“檢驗”角度，而沒有從“分析”角度去考慮。供試品溶液作為分析方法的研究對象，以藥典一部、二部任一“分析方法”的描述體例來看，一部的格式是“供試品溶液的制備”，而二部的格式則是“供試品溶液”。很明顯，一部的描述更為恰當(dāng)。對“分析方法”來說，供試品溶液不僅包括研究對象的溶解，還包括提取、溶出、轉(zhuǎn)移等過程。筆者認(rèn)為，清潔驗證的取樣就相當(dāng)于提取、溶出、轉(zhuǎn)移。第三，是否參與計算的問題。從本文“2.2”和“2.3”的情況來看，在最終的清潔驗證結(jié)論判定時，檢驗方法回收率并沒有參與計算，參與計算的只是取樣方法回收率。因此，筆者認(rèn)為，取樣方法回收率的研究已經(jīng)包括了檢驗方法回收率，結(jié)合藥典一部中提及的分析方法的涵蓋范圍及取樣回收率操作的整體過程來看，檢驗方法回收率僅是取樣方法回收率中的一個環(huán)節(jié)，因此，建議將其調(diào)整為“分析方法回收率”的概念更為準(zhǔn)確。3.2回收率研究的必要性鑒于本文已經(jīng)提出了統(tǒng)一的“分析方法回收率”的概念，以下討論的回收率指的即是取樣方法回收率或分析方法回收率。從國內(nèi)外發(fā)生的一些藥害事件，如美國消膽胺樹脂的召回事件、上海華聯(lián)制藥廠甲氨蝶呤藥害事件等[30]，均是高風(fēng)險產(chǎn)品（待清潔產(chǎn)品的活性或毒性遠(yuǎn)大于后續(xù)生產(chǎn)產(chǎn)品）引起的。因此，對于殘留限度相差很大的產(chǎn)品，筆者認(rèn)為最好不要共線生產(chǎn)；即使共線生產(chǎn)，也要根據(jù)不同的活性/毒性、服用劑量、清潔難易程度以及批量等各種因素對所有品種分組，使用不同的清潔方法，進(jìn)而分別清潔驗證。此種情況下的清潔驗證，回收率的研究是必要的。對于交叉污染風(fēng)險很小的產(chǎn)品，共線生產(chǎn)的品種殘留限度普遍較高的情況下，筆者建議可采用限度雜質(zhì)測定的驗證指標(biāo)來考察分析方法，無須對回收率進(jìn)行研究。因為除了清潔驗證所采用的最差條件和分析方法回收率相對較高的RSD（RSD高即說明準(zhǔn)確性低），在殘留限度的評估分析時，也會因引用不同的安全（調(diào)整）因子[31