hplc法同時測定護肝片中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量

hplc法同時測定護肝片中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量

肝保護片由柴胡和五味子組成。從1995年到2010年，中國的藥店都記錄了這一功能，具有平肝理氣、健脾消食、活血化瘀、減少轉(zhuǎn)氨酶等作用?，F(xiàn)代藥理研究證實方中五味子所含五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素等多種木脂素類化合物是其降低轉(zhuǎn)氨酶的主要有效成分,尤以五味子乙素最明顯。2010年版中國藥典和文獻報道對護肝片中五味子的質(zhì)量控制多是選取1種或2種指標(biāo)性成分,目前尚未有同時測定護肝片中五味子3種木脂素成分的報道。本文以五味子中含量較高的五味子醇甲和護肝作用最強的五味子乙素作指標(biāo),確定了提取方法,建立了HPLC同時測定護肝片中3種木脂素成分含量的方法,以期為控制護肝片中五味子的質(zhì)量提供參考依據(jù)。1對照品和試劑Angilent1200型高效液相色譜儀,ShimadzuLC-10A可見紫外分光光度計,Precisa92SM-202DA電子天平,AS5150A超聲波清洗器。五味子醇甲(110857、200709)、五味子甲素(110764、200408)、五味子乙素(110765-200508)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,色譜純;其他試劑均為分析純;水為娃哈哈純凈水。柴胡、茵陳、板藍根、綠豆、南五味子和北五味子、豬膽粉均購自信陽市藥品公司,經(jīng)本所潘永峰副主任中藥師鑒定為正品。3個廠家的護肝片均為市售:公司A批號為100606,公司B批號為20100808083,公司C批號為100804。2柱溫度和溫度AngilentEclipseXDB-C18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm),流動相甲醇-水梯度洗脫,其中甲醇濃度(V/V)60%(0～8.00min);60%→74%(8.01～10.00min);74%(10.01min～30.00min);74%→60%(30.01～31.00min);檢測波長250nm,柱溫25℃,流速1.0mL·min-1,進樣量10μL。取批號為100606的樣品,比較正己烷索氏提取6h、甲醇超聲提取(30min、60min)、甲醇回流提取(30min、60min)、乙酸乙酯超聲提取(30min、60min)、乙酸乙酯回流提取(30min、60min)等不同溶劑系統(tǒng)的提取效率,結(jié)果甲醇回流30min提取時五味子醇甲和五味子乙素的含量均最高,干擾峰較少且分離較好,故選甲醇回流30min作為樣品的制備方法。2.3方法的回收率2.3.1對照品溶液制備:精密稱取10.95mg五味子醇甲、7.75mg五味子甲素、7.35mg五味子乙素對照品,用甲醇作溶劑分別溶解于25mL量瓶中,再分別精密量取2mL置10mL量瓶中,用甲醇定容,得3種成分分別為87.60、62.00、58.80μg·mL-1的溶液,供分析進樣和加標(biāo)回收用。2.3.2樣品溶液制備:取本品10片,除去包衣,精密稱定,研細,取0.7g,精密稱定,加甲醇25mL加熱回流30min,放冷,濾過,用甲醇30mL分次洗滌濾渣及容器,洗液與濾液合并,回收至小體積,轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。2.3.3陰性樣品溶液制備:根據(jù)2010年版藥典的護肝片處方,制備不含五味子藥材的陰性樣品,按上述方法操作,即得。2.4線性范圍和精密度2.4.1系統(tǒng)適用性實驗:分別吸取對照品混合溶液、批號為100606的供試品溶液、陰性樣品溶液,自動進樣10μL,記錄色譜圖(見圖1)。3種木脂素峰能完全分離,陰性樣品不干擾測定。2.4.2線性關(guān)系考察:精密吸取對照品混合溶液1、5、10、15、20μL,自動進樣,以峰面積積分值對進樣量(μg)進行回歸處理,得五味子醇甲、甲素和乙素3種木脂素的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=876.79x-1648r=0.9993,y=603.95x-1132.8r=0.9993,y=518.37x-971.15r=0.9992;線性范圍分別為0.088～1.752,0.062～1.240,0.059～1.176μg。結(jié)果表明,每種木脂素成分在其線性范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。2.4.3精密度實驗:精密吸取對照品混合溶液10μL,重復(fù)進樣6次,記錄峰面積。結(jié)果3種木脂素峰面積的RSD分別為0.5%、0.3%、0.6%,表明本方法精密度良好。2.4.4穩(wěn)定性實驗:取批號為100606的樣品溶液,分別于0、1、3、6、9、12h進樣10μL,記錄峰面積。計算3種木脂素峰面積的RSD分別為1.1%、0.7%、1.2%,表明供試品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.4.5重復(fù)性實驗:取批號為100606的樣品,按“2.3.2”項下相應(yīng)的方法制備5份供試品溶液,分別進行測定。計算3種木脂素含量的RSD分別為1.3%、2.1%、1.7%,表明供試品溶液重復(fù)性良好。2.4.6加樣回收率實驗:精密稱取已知含量的批號為100606的樣品約0.7g,再精密加入對照品混合溶液5mL,按“2.3.2”項方法平行制備5份樣品溶液(各組分在樣品中的加入量為:五味子醇甲262.8μg,五味子甲素186.0μg,五味子乙素176.4μg)按“2.1”項下方法測定,記錄色譜圖,計算3種木脂素平均回收率為100.6%、101.2%、99.6%,RSD(n=5)分別為1.3%、1.7%、1.1%。2.4.7樣品測定結(jié)果:按照“2.3.2”項下相應(yīng)的處理方法,分別稱取3個批號樣品制備供試品溶液,分別進樣10μL,測定峰面積,代入線性回歸方程,計算每片樣品中五味子醇甲、甲素和乙素的平均含量(見表1)。3討論3.1藥中藥代動力學(xué)及藥化學(xué)成分的含量文獻研究表明,五味子的近似種和混淆品較多,木脂素類成分在不同五味子屬藥材中的類型及其含量有顯著差別,并且他們的含量并不嚴(yán)格呈正相關(guān),藥材中五味子醇甲含量高不一定五味子乙素或五味子甲素的含量也高。同時測定護肝片中五味子醇甲、甲素和乙素3種成分較測一種成分能更好地判定其中五味子藥材質(zhì)量的優(yōu)劣,并提高方法的專屬性。3.2藥代動力學(xué)測定波長的確定試驗中分別取一定濃度的3種木脂素對照品的甲醇溶液,于紫外區(qū)全波長掃描,在液相色譜儀上測定不同波長處對照品和同一濃度樣品的峰面積,結(jié)果表明五味子甲素和五味子乙素250nm處的吸收度、峰面積均比254nm處的高,五味子乙素的護肝作用又最強,故選250nm作測定波長。3.3色譜條件選擇實驗研究了不同比例的甲醇-水系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)最后出峰的五味子乙素保留時間隨甲醇比例的變化有大幅的改變(甲醇體積改變2%變化5～10min),欲使3種木