切除眼柄對幼蟹卵巢發(fā)育的影響

切除眼柄對幼蟹卵巢發(fā)育的影響

甲殼動物蝦和螃蟹的卵生長受神經(jīng)系統(tǒng)和分泌系統(tǒng)的控制。其中，神經(jīng)節(jié)、腦和胸神經(jīng)節(jié)在卵道發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)元素x-上鞘組（mih）和性腺激素（gih）的分泌。第一種通過y器官的間接影響卵巢發(fā)育，第二種直接抑制卵巢發(fā)育。此外，外部因素中的類固醇激素也起著重要作用。中華絨螯蟹又名河蟹,為最重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物之一,其養(yǎng)殖技術(shù)日漸成熟,但生殖調(diào)控規(guī)律的研究比較欠缺。顧志敏等(1991)認為切除單側(cè)眼柄對河蟹卵子的成熟無顯著的誘導(dǎo)作用;雙眼切除的中華絨鰲蟹能誘導(dǎo)卵巢的成熟(羅榮生1990);而眼柄切除對幼蟹卵巢發(fā)育的作用未見報道,為此作者通過切除單側(cè)、雙側(cè)眼柄及注射黃體酮藥物來研究對幼蟹卵巢發(fā)育的影響,一方面可以豐富河蟹生理學(xué)方面的資料,另一方面為養(yǎng)殖生產(chǎn)提供一些理論依據(jù)。1材料和方法1.1飼料配方及飼養(yǎng)時間實驗動物為第2年蟹種,選取雌蟹60只,隨機分為5組,每組12只,5組分別為對照組、酒精注射組、黃體酮注射組、單側(cè)眼柄切除組和雙側(cè)眼柄切除組,實驗蟹均放于3m×3.5m×1m的水泥池中,池水深度30～40cm,飼喂以配合飼料為主,輔助魚蝦,早晚各1次,配合飼料配方及主要營養(yǎng)成分見表1。定期換水充氣,飼養(yǎng)時間5月10日～7月6日。實驗前均稱重及測量體長和體寬。1.2黃體酮注射液內(nèi)注射酒精灼燙擠壓法切除雙側(cè)眼柄或右側(cè)眼柄。從基節(jié)和底節(jié)間關(guān)節(jié)膜注入0.1μg黃體酮/g體重(10mg/ml黃體酮注射液溶于1%的乙醇中),20d后再注射1次。酒精對照組注射相同劑量的1%酒精。實驗結(jié)束后稱量體重,然后無菌操作解剖取出卵巢及肝胰腺,分別稱重,波恩氏液固定性腺24h,系列酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色,Olympus顯微鏡觀察(顧志敏等1991)。1.2.1顯微外觀與統(tǒng)計顯微鏡觀察并測量卵母細胞直徑,細胞直徑以(細胞短徑+細胞長徑)/2計算,每個切片測定50個卵母細胞。1.2.2組織指數(shù)及蛻殼頻率計算實驗結(jié)束后分別稱量各實驗組體重、卵巢和肝胰腺重量,統(tǒng)計蛻殼次數(shù),并計算如下指標(biāo):卵巢指數(shù)計算:(卵巢重/體重)×100肝胰腺指數(shù)計算:(肝胰腺重/體重)×100卵巢肝胰腺質(zhì)量比計算:卵巢重/肝胰腺重平均增重率計算:[(結(jié)束平均體重-起始平均體重)/起始平均體重]×100蛻殼頻率計算:(蛻殼總次數(shù)/起始只數(shù))×1001.2.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和處理采用SPSS統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),結(jié)果以Xˉˉˉ±SEXˉ±SE表示。2結(jié)果2.1各組大鼠眼柄增重率、成活率比較實驗歷經(jīng)55d,爾后進行體重、卵巢和肝胰腺稱量,蛻殼次數(shù)統(tǒng)計,平均增重率、成活率、蛻殼頻率計算,結(jié)果見表2。從表2可看出,平均增重率以雙側(cè)眼柄切除組最高,依次是單側(cè)眼柄組、藥物組、酒精對照組、對照組。成活率以雙側(cè)眼柄切除組最低,其次是酒精對照組,其他3組均較高為91.7%。蛻殼頻率以雙側(cè)眼柄切除組為最高達233.3%,其次為單側(cè)眼柄切除組為108.3,酒精對照組為最低91.7%。2.2兩組小鼠精子nd-pcr的卵指數(shù)、肝胰腺指數(shù)變化實驗結(jié)束后,在稱量的基礎(chǔ)上計算了卵巢指數(shù)、肝胰腺指數(shù)及卵巢肝胰腺質(zhì)量比等指標(biāo),結(jié)果見表3。從表3可看出,雙側(cè)眼柄切除組及單側(cè)眼柄切除組河蟹的卵巢指數(shù)均極顯著高于對照組,藥物組和酒精對照組卵巢指數(shù)也高于對照組,但未達統(tǒng)計上的顯著水平。雙側(cè)眼柄切除組河蟹的肝胰腺指數(shù)極顯著高于對照組,其他3組雖高于對照組,未達統(tǒng)計學(xué)上的顯著水平。雙側(cè)眼柄切除組及單側(cè)眼柄切除組河蟹的卵巢肝胰腺質(zhì)量比均極顯著高于對照組,其他兩組略有增加。2.3生殖細胞顯微組織形態(tài)觀察參照顧志敏等(1991)對河蟹卵巢發(fā)育分期情況,實驗結(jié)束后除雙側(cè)眼柄切除組河蟹卵巢發(fā)育進入Ⅲ期、生殖細胞以初級卵母細胞大生長期前期為主外,其他4組均為Ⅱ期,生殖細胞以初級卵母細胞小生長期為主,顯微測定了卵母細胞直徑,結(jié)果見表4。從表4可看出,雙側(cè)眼柄切除組、單側(cè)眼柄切除組及藥物組的卵母細胞直徑均極顯著高于對照組,酒精對照組略低于對照組。3切除雙側(cè)眼柄,促進重新犯罪率和前因子檢測甲殼動物的眼柄是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)(x器官-竇腺復(fù)合體)的所在地,它制造和分泌對蛻皮和性腺發(fā)育起調(diào)節(jié)作用的多肽-蛻皮抑制激素(MIH)和性腺抑制激素(GIH),眼柄切除后MIH撤退而活化Y器官,促使其分泌蛻皮激素,所以切除眼柄可促進蛻皮,縮短蛻皮間期。Molyeaux等(1988)切除幼堪察加擬石蟹雙側(cè)眼柄,明顯減少了蛻皮間隔時間,而單眼切除則不能減少蛻皮間隔時間。顧志敏等(1991)指出對青春期蛻殼前的蟹切除任意一側(cè)眼柄都能有效促進蛻殼、生長及性腺的早期發(fā)育。本實驗也充分說明了這一點,切除幼蟹雙側(cè)眼柄,可使蛻殼頻率大大增加,第1只河蟹蛻殼時間為18d,單側(cè)眼柄切除組第1只河蟹蛻殼時間為56d,其他3組最少的為63d。Adiyodi等(1970)認為蛻皮激素對性腺成熟的早期階段,即卵原細胞有絲分裂有必不可少的促進作用。羅榮生等(1990)發(fā)現(xiàn)河蟹卵母細胞小生長期存在高水平的循環(huán)20-羥基蛻皮酮。性腺抑制激素(GIH)的分子量在2000～3000Da之間(顧志敏1991),靶器官為肝胰腺、卵巢,抑制雌蟹的卵黃發(fā)生及性腺刺激因子的生成,對肝胰腺合成卵黃蛋白具有抑制作用(Warrieretal.2001),切除雙側(cè)眼柄,GIH的消失解除了對卵巢的抑制,促進卵巢發(fā)育。青春蛻殼后無眼柄蟹的卵巢/肝胰腺濕重比值增高,卵母細胞直徑顯著增大(羅榮生1990)。羅榮生(1993)將竇腺埋植到已除去眼柄的幼齡招潮蟹體內(nèi),卵巢的提前發(fā)育就受到抑制(但不完全);作者發(fā)現(xiàn)切除幼蟹雙側(cè)眼柄,可使河蟹的卵巢指數(shù)、肝胰腺指數(shù)、卵巢肝胰腺質(zhì)量比及卵母細胞直徑極顯著高于對照組,單側(cè)眼柄的切除由于抑制作用解除較小,雖然出現(xiàn)卵巢指數(shù)、卵巢肝胰腺質(zhì)量比及卵母細胞直徑極顯著高于對照組,但與雙側(cè)眼柄切除相比差距較大。此外本實驗過程中發(fā)現(xiàn)雙側(cè)眼柄切除的河蟹具有較高的死亡率,且大部分為蛻殼不遂死亡,原因可能是x器官-竇腺復(fù)合體可分泌多種激素,其中有許多是調(diào)節(jié)機體代謝的物質(zhì),這些物質(zhì)的不足或缺乏可能會引起一些副作用,所以建議最好不要采取切除雙側(cè)眼柄的辦法促進性腺發(fā)育。同脊椎動物一樣,性類固醇激素在甲殼動物卵巢發(fā)育過程中起著重要作用。鋸緣青蟹卵黃開始形成時,肝胰腺和血淋巴中17β-雌二醇和孕酮急劇增加,17β-雌二醇的最大濃度在肝胰臟,而孕酮則在卵巢(Warrier2001)。趙維信等(1996)指出不論低濃度還是高濃度的黃體酮對羅氏沼蝦的離體卵巢卵黃發(fā)生期前和卵黃發(fā)生期卵母細胞卵徑增大均有極顯著的刺激作用;Kulkarni(1979)給蛻皮期間的哈氏仿對蝦成蝦從節(jié)間膜隔天注入10μg黃體酮(溶于10μl的1%乙醇)到腹部肌肉中,10d、21d后卵母細胞的直徑分別為(111.75±6.25)μm和(121.25±4.5)μm,比對照組的(88.75±7.75)μm明顯大。Kulkarni還發(fā)現(xiàn)黃體酮可促進未成熟蝦的生殖細胞發(fā)育為卵原細胞,后者又很快發(fā)育為卵母細胞。Yano(1985)用處于卵巢發(fā)育Ⅰ期的刀額新對蝦為材料,黃體酮用量為0.1μg/g體重,僅注射1次,28d后用藥組15只蝦中,2只達到Ⅱ期的卵巢發(fā)育,4只到Ⅲ期,2只到Ⅴ期并產(chǎn)卵,而對照組15只僅發(fā)育到Ⅱ期;10-9mol/L和10-12mol/L黃體酮可使體外培養(yǎng)的羅氏沼蝦Ⅱ期和Ⅲ期卵巢的卵母細胞直徑顯著增大