黃連、梔子、五味子、羌活的薄層鑒別及黃芩苷的含量測定

黃連、梔子、五味子、羌活的薄層鑒別及黃芩苷的含量測定

黃梔子是黃梔子、黃連、梔子、五味子和羌活等七味藥物加工而成的膜衣。具有舒肝健脾消食的功效。主要用于慢性肝炎、早肝硬化等疾病的治療。這是中藥的一種新藥物。本研究主要采用薄層色譜法對方中主要藥味進行了定性鑒別,同時采用高效液相色譜法測定方中君藥黃芩中主要有效成分黃芩苷的含量,并制定了相應(yīng)的含量測定限度。本研究所建立的定性定量測定方法專屬性較好,能用于黃梔護肝片的質(zhì)量控制。1設(shè)備和材料1.1譜儀檢測系統(tǒng)Waters2695-2487高效液相色譜儀(Waters996二極管陣列檢測器);MettlerAE240電子天平;2F-2三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)。1.2試劑與檢測方法黃梔護肝片(自制);五味子乙素對照品(110765-200609)、黃連對照藥材(120913-200407)、梔子苷對照品(110749-200714)、梔子對照藥材(120986-200605)、羌活對照藥材(120935-200506),黃芩苷對照品(110715-201016)均由中國藥品生物制品檢定所提供,甲醇為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1膜層析成像2.1.1陰性樣品溶液取本品5片,研細,加甲醇10mL,超聲處理30min,放冷,過濾,濾液作為供試品溶液。另取缺黃連的陰性樣品1g,同法制成陰性樣品溶液。再取黃連對照藥材0.1g,同法制成對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各2μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以甲苯–乙酸乙酯–甲醇–異丙醇–水(體積比為6∶3∶1.5∶1.5∶0.3)為展開劑,置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi),展開,取出,晾干,置紫外光燈(365nm)下檢視,樣品色譜在對照藥材相應(yīng)位置上顯相同顔色的斑點,且陰性無干擾,結(jié)果見圖1。2.1.2梔子苷對照品溶液取本品10片,研細,加乙醚30mL,超聲10min,棄去乙醚,藥渣揮干,加乙酸乙酯40mL,加熱回流1h,取出,放冷,過濾,濾液蒸干,殘渣加甲醇2mL溶解,過濾,濾液作為供試品溶液。取梔子對照藥材同法制成對照藥材溶液。另取缺梔子的陰性樣品2g,同法制成陰性樣品溶液。再取梔子苷對照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作為對照品溶液。吸取上述4種溶液各5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯–丙酮–甲酸–水(體積比為10∶6∶2∶0.5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%的硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點顯色清晰,進行檢視,樣品色譜在對照品和對照藥材相應(yīng)的位置有相同顔色的斑點,且陰性無干擾,結(jié)果見圖2。2.1.3味子的制備取本品10片,研細,置燒瓶中,加正己烷50mL,冷浸過夜,于80～85℃加熱回流2h,過濾,濾液低溫蒸干,殘渣加乙酸乙酯2mL溶解,作為供試品溶液。另取缺五味子的陰性樣品2.5g,同法制成陰性樣品溶液。再取五味子乙素對照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各2μL,分別點于同一硅膠GF254薄層板上,以甲苯–乙酸乙酯(體積比為9∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254nm)下檢視,樣品色譜在對照品相應(yīng)的位置有相同顔色的斑點,且陰性無干擾,結(jié)果見圖3。2.1.4對照藥材溶液取本品20片,研細,加乙醚20mL,振搖提取,取乙醚提取液,使乙醚揮發(fā)至約0.5mL,作為供試品溶液。另取羌活對照藥材0.5g加乙醚1mL浸提,過濾,取濾液作為對照藥材溶液。吸取上述2種溶液各5μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以石油醚–乙醚(體積比為95∶5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,進行檢視,樣品色譜在對照藥材相應(yīng)位置上顯相同顔色的斑點,且陰性無干擾,結(jié)果見圖4。2.2重量測定2.2.1車橋總黃花酸堿巖中黃芪苷檢測色譜柱:DiamonsilC18(4.6mm×200mm,5μm);流動相:甲醇體積∶水體積∶冰醋酸體積(50∶50∶1);流速:1mL/min;柱溫:35℃;檢測波長:274nm。理論塔板數(shù)大于1500,黃芩苷與雜質(zhì)峰分離效果好,保留時間適中,陰性樣品無干擾。對照品、供試品、陰性樣品HPLC圖分別見圖5、圖6、圖7。2.2.2供試品溶液制備取本品,研細,取2.5g,精密稱定置50mL量瓶中,加50%甲醇50mL,超聲處理30min,取出,放冷,加50%甲醇至刻度,搖勻,過濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液。2.2.3對照溶液的制備取黃芩苷對照品適量,精密稱定,加50%甲醇配制成0.182mg·mL-1的對照品溶液。2.2.4準(zhǔn)分離主溶液的制備取缺黃芩陰性樣品,按供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。2.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線方程精密吸取對照品溶液2,4,8,12,16,20μL,注入液相色譜儀,按上述色譜條件測定。以進樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積值(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=1100.1x+20.816;r=0.9998。黃芩苷進樣量在0.364～3.64μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。2.2.6精密度測試取對照品溶液10μL,連續(xù)進樣5次,測得黃芩苷峰面積RSD為0.28%,表明儀器精密度良好。2.2.7重復(fù)性試驗取同一批樣品(批號110302),按供試品溶液的制備方法,制備6份供試品溶液,分別進樣10μL,黃芩苷峰面積RSD值為1.20%,表明重復(fù)性較好。取對照品溶液和供試品溶液,分別在0,1,2,4,8,16,24h各進樣10μL,黃芩苷峰面積RSD值為0.29%,表明對照品溶液和供試品溶液在48h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.2.9加樣回收率試驗取已知含量(3.76mg/g)的同一批樣品6份,按《中國藥典》2010版附錄項下測定加樣回收率,6次試驗回收率分別為99.94%、99.48%、99.92%、100.23%、99.69%、99.38%,平均回收率為99.77%,RSD值為0.32%,見表1。結(jié)果表明,供試品溶液的制備及測定方法專屬性好,合理可行。2.3不同麻黃苷含量的結(jié)果取不同批號的5批樣品,按擬定的方法進行測定,測得5批樣品中黃芩苷含量分別為3.80,3.92,3.94,3.85,4.09mg/g,結(jié)果見表2。按上述測定結(jié)果平均值的80%,暫定樣品中黃芩苷含量不得低于3.136mg/g。3提取溶劑的選擇含量測定中,對超聲提取和回流提取進行了比較,結(jié)果表明采用超聲提取黃芩苷含量較高,并且方法簡便、節(jié)省時間。在提取溶劑方面,比較了純甲醇、50%甲醇、80%甲醇對樣品中黃芩苷提取效果的影響,結(jié)果50%甲醇提取率最高,因此選用50%甲醇作為提取溶劑。提取時