鐵皮石斛不同極性提取物體外抗氧化活性研究

鐵皮石斛不同極性提取物體外抗氧化活性研究

自由基理論認為，體育性疾病、癌、炎癥和免疫疾病與自由基代謝失衡有關(guān)。因此，如果體內(nèi)自由基保持動態(tài)平衡，就可以對付由活性氧及其由此產(chǎn)生的脂質(zhì)氧化引起的疾病。過氧化反應(yīng)直接消除殘余自由基，有效防止或減少體內(nèi)自由基引起的氧化損傷，治療與生育性氧氣毒性有關(guān)的疾病。植物中的天然活性劑有效且無害，因此深受人們歡迎。因此，科學家多年來一直從具有抗逆性活性的植物中尋找阻力的物質(zhì)基礎(chǔ)，然后發(fā)現(xiàn)具有抗逆性活性的天然化合物。根據(jù)研究，天然化合物主要來源于植物的多酚和黃酮類。石斛是常用名貴中藥材,為蘭科(Orchidaeae)石斛屬(Dendlvbium)多種植物的新鮮或干燥莖的統(tǒng)稱.傳統(tǒng)中醫(yī)常將其用于滋陰清熱、生津益胃、止咳潤肺,現(xiàn)代藥理研究表明石斛具有多種醫(yī)藥功效,可預防和治療白內(nèi)障、增強免疫功能、治療腫瘤、降血糖、抗氧化等,在臨床中應(yīng)用相當廣泛.目前我國76種石斛屬植物中,有近40種被作為藥用.其中鐵皮石斛(Dendrobiumof?cinale)是藥典明確收載的藥用石斛之一,主要分布于我國西南和江南各省,是珍稀名貴藥用石斛.研究表明,鐵皮石斛主要含石斛多糖、生物堿、氨基酸、微量元素和菲類化合物等有效成分.有文獻報道鐵皮石斛中存在黃酮及多酚類化合物,但目前還未見其黃酮及多酚化合物的制備及相關(guān)生物活性的報道.因此我們擬在前人對鐵皮石斛藥用價值研究的基礎(chǔ)上考察鐵皮石斛不同極性提取物的抗氧化活性,并探討其與多酚及黃酮含量的相關(guān)性,以期尋找鐵皮石斛抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料和試劑1.1.1儀器、設(shè)備和從物鐵皮石斛購自云南普洱,于60℃下烘干備用.紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器),高速粉碎機(永康市久品工貿(mào)有限公司),電子分析天平(奧斯豪儀器有限公司),電熱恒溫水浴鍋(上海越磁電子科技有限公司),臺式高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司).1.2實驗方法1.2.1殘留液的提取新鮮鐵皮石斛莖清洗、烘干、粉碎成粉末備用.取鐵皮石斛莖粉末于400mL的燒杯中,加75%乙醇室溫提取(3×200mL,每次6h).殘渣加95%乙醇室溫提取(3×400mL,每次6h).合并上述提取液,減壓濃縮至浸膏狀.標明EE.取部分樣品(約總量的3/4)用85%乙醇溶解,氯仿萃取(3×100mL),氯仿層減壓濃縮至少量,烘干,標明CE.將上述步驟中的殘留液用乙酸乙酯萃取(3×100mL),乙酸乙酯層減壓濃縮至少量,烘干,標明EAE.殘留液繼續(xù)加入正丁醇萃取(3×100mL),正丁醇層濃縮至少量,烘干,標明NBE.1.2.2標準曲線的繪制和測定沒食子酸標準儲備液:準確稱取0.2500g沒食子酸標準品,用少量蒸餾水溶解,定容于250mL容量瓶中,搖勻,其質(zhì)量濃度為1.00mg/mL.沒食子酸標準使用液:精密量取沒食子酸標準儲備液5.00mL于100mL容量瓶中,加水至標線,搖勻,其質(zhì)量濃度為0.050mg/mL.精密量取沒食子酸標準儲備液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL于100mL容量瓶中,用蒸餾水定容,配成標準系列.分別吸取標準系列溶液1.00mL于比色管中,加入0.3mLFC試劑,混勻,再加入1.5mL7%碳酸鈉溶液,加水定容至10mL,充分振搖,室溫下靜置20min.以試劑空白作參比,用1cm比色皿測定波長760nm處的吸光度.以測得的吸光度為縱坐標(y)、沒食子酸溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(x,μg/mL)繪制標準曲線,得到線性回歸方程.將樣品配置成1.00mg/mL,吸取試樣溶液1.00mL于比色管中,加入0.3mLFC試劑,混勻,再加入1.5mL飽和碳酸鈉溶液,加水定容至10mL,充分振搖,室溫下靜置20min.以試劑空白作參比,用1cm比色皿測定波長760nm處的吸光度.根據(jù)測得的吸光度和標準曲線回歸方程,計算樣品中的多酚含量(以沒食子酸計).1.2.3標準曲線a-c含量的測定精密稱取蘆丁對照品20mg,置100mL容量瓶中,加95%乙醇50mL使溶解,然后加50%乙醇稀釋至刻度,即得0.2mg/mL的對照品溶液.精密量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,分別置于10mL容量瓶中,各加50%乙醇溶液使成5mL,精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL,搖勻,放置6min,加入10%硝酸鋁溶液0.3mL,搖勻,再放置6min,加入1mol/L氫氧化鈉溶液4mL,分別用50%乙醇稀釋至刻度,搖勻,放置15min.以第一瓶作空白,用可見分光光度計在510nm處測其吸收度,作A-C標準曲線(或計算其回歸方程).精密量取提取液1mL,按上述標準曲線制備方法進行測定,并由標準曲線或回歸方程計算樣品中總黃酮的含量.1.2.4vc清除abts活性將各樣品及Vc標準品配制成濃度為3000μg/mL、1500μg/mL、750μg/mL、375μg/mL、187.5μg/mL、93.75μg/mL、46.875μg/mL的樣品液.分別取Vc及各樣品液0.1mL,加入1mL的ABTS溶液(A734nm=0.70±0.02),充分混合,室溫避光放置20min,用紫外分光光度計734nm處測定吸光度.空白對照用超純水代替樣品液,重復3次.按下式計算清除率:清除率=(A空白對照-A樣品)/A空白對照×100%.其中,A為吸光度.1.2.5清除vc的制備將各樣品及Vc標準品配制成濃度為3000μg/mL、1500μg/mL、750μg/mL、375μg/mL、187.5μg/mL、93.75μg/mL、46.875μg/mL的樣品液.分別取Vc及各樣品液0.3mL,加入0.9mL的DPPH甲醇溶液(0.1mmol/L),室溫暗反應(yīng)30min,紫外分光光度計517nm處測定吸光度.空白對照用超純水代替樣品液,重復3次.按下式計算清除率:清除率=(A空白對照-A樣品)/A空白對照×100%.其中,A為吸光度.1.2.6清除總有機溶劑.將各樣品及Vc標準品配制成濃度為3000μg/mL、1500μg/mL、750μg/mL、375μg/mL、187.5μg/mL、93.75μg/mL、46.875μg/mL的樣品液.采用羥自由基試劑盒檢測,紫外分光光度計550nm處測定吸光度.空白對照用超純水代替樣品液,重復3次.計算清除率.1.2.7樣品溶液的制備將各樣品及Vc標準品配制成濃度為3000μg/mL、1500μg/mL、750μg/mL、375μg/mL、187.5μg/mL、93.75μg/mL、46.875μg/mL的樣品液.分別移取Vc標準品及各樣品液0.5mL,加入磷酸鹽PBS(pH6.6、0.2mol/L)2.5mL和30mmol/L鐵氰化鉀溶液2.5mL充分混合,50℃水浴20min.分別向各反應(yīng)液加入2.5mL三氯乙酸(0.6mol/L)混合均勻.分別取上清液2.5mL,各加入2.5mL超純水和0.5mL三氯化鐵(6mmol/L),搖勻,紫外分光光度計700nm處測定其吸光度.空白對照用蒸餾水代替樣品液,重復3次求平均值.2結(jié)果與分析2.1吸附過程中鐵皮石斛總多酚和總黃酮含量的測定以沒食子酸為標準對照,福林酚法測總多酚含量得標準曲線為y=9.2519x+0.0201(R2=0.9998).以蘆丁為標準對照,測總黃酮含量得標準曲線y=1.0787x+0.0003(R2=0.9996).鐵皮石斛各樣品中總多酚和總黃酮含量結(jié)果見表1.從表1可知各樣品總多酚含量規(guī)律為CE>EAE>NBE>EE,且CE的總黃酮含量最高,NBE最低.2.2abts清除效果樣品和Vc對ABTS自由基的清除能力(圖1A)呈現(xiàn)一定的濃度依賴性.其中樣品CE濃度為375μg/mL,樣品EE濃度為750μg/mL,樣品EAE和樣品NBE濃度均為1500μg/mL時,對ABTS自由基的清除率均能達到100%.樣品清除ABTS的半抑制率從大到小為EAE>NBE>EE>CE.結(jié)果表明所有樣品均對ABTS自由基有良好的清除能力,樣品CE效果最佳,其IC50為88.82μg/mL(表2).2.3dpph自由基清除能力樣品和Vc對DPPH自由基的清除能力(圖1B)呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,且各樣品對DPPH自由基的清除能力大小為CE>EE>NBE>EAE,樣品清除DPPH的半抑制率從大到小為CE>EE>NBE>EAE.其中CE的IC50最小為394.62μg/mL,EAE的IC50最大為1833.15μg/mL(表2).2.4eae的清除能力樣品對羥自由基的清除能力呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(圖1C).在低濃度時,樣品EAE對羥自由基的清除能力最強,超過陽性對照.隨濃度增加,各樣品的清除能力趨于平穩(wěn),而樣品EAE的活性明顯高于其他提取物,其IC50為714.19μg/mL,樣品NBE的IC50最大為2102.91μg/mL(表2).2.5還原力測定各樣品的還原結(jié)果(圖2)顯示,樣品對羥自由基的清除能力呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,而不同的樣品對羥自由基的清除能力也不同,陽性對照Vc的還原能力明顯大于各樣品.各樣品中CE的還原能力最強,在高濃度時,接近陽性對照,IC50為905.06μg/mL(表2).樣品EE和NBE也表現(xiàn)出較強的還原力,其IC50分別為1498.07μg/mL和2567.17μg/mL(表2).而樣品EAE還原力最弱.2.6還原能力與黃酮含量相關(guān)性4種提取物抗氧化活性與總酚含量和總黃酮含量之間的相關(guān)性(表3)顯示,各提取物對ABTS、DPPH清除能力以及還原性與黃酮含量相關(guān)性較強,相關(guān)系數(shù)分別為0.845、0.902和0.994.羥自由基的清除能力與樣品中的多酚含量明顯相關(guān),其相關(guān)系數(shù)為0.521,而與黃酮含量相關(guān)性較弱(相關(guān)系數(shù)為-0.156).各提取物的還原能力與其多酚含量也有一定相關(guān)性,其相關(guān)系數(shù)為0.600.而ABTS和DPPH自由基的清除與多酚含量相關(guān)性較弱.3復合提取物抗氧化活性的機制資料顯示,植物中酚類化合物是一種天然抗氧化劑,其中多酚和黃酮中酚羥基結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu),同時對活性氧等自由基具有很強的捕捉能力,這使得多酚和黃酮具有較強的抗氧化性以及清除自由基的能力,且抗氧化活性的強弱與其所含多酚和黃酮類成分含量的高低具有較高的相關(guān)性.我們的實驗結(jié)果表明,鐵皮石斛各極性提取物均有一定的抗氧化活性,其中樣品CE對ABTS、DPPH自由基清除效果最好,還原性最強,其IC50分別為88.82μg/mL、394.62μg/mL和905.06μg/mL.而樣品EAE對羥自由基清除效果最好,其IC50為714.19μg/mL,其次是樣品CE(IC50為1589.03μg/mL).通過相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn),各提取物抗氧化活性與總酚含量和總黃酮含量之間有明顯的相關(guān)性,對ABTS、DPPH清除能力以及還原性與黃酮含量相關(guān)性較強,羥自由基的清除能力與樣品中的多酚含量明顯相關(guān).即實驗樣品的抗氧化活性與多酚和黃酮含量均密切相關(guān).這也充分證明了鐵皮石斛抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)可能就是多酚或黃酮,因此我們尋找鐵皮石斛的抗氧化活性成分應(yīng)從多酚或黃酮類成分著手.同時研究還發(fā)現(xiàn)不同的抗氧化體系與鐵皮石斛中的多酚和黃酮相關(guān)性表現(xiàn)各異,這可能是由于鐵皮石斛中多酚和黃酮的種類及結(jié)構(gòu)不同所引起的.研究表明,植物酚類含量及種類與抗氧化活性強弱有關(guān).如在多酚抗油脂氧化性實驗中,有研究者發(fā)現(xiàn)表棓兒茶素棓酸酯>棓酸>表棓兒茶素>咖啡酸>表兒茶素>阿魏酸>鞣花酸.而在黃酮類化合物抗氧化活性強弱的研究中,有人發(fā)現(xiàn)黃酮結(jié)構(gòu)中具有B-4’-OH時其抗氧化活性強于B環(huán)其他羥基基團,而C-3-OH基則無抗氧化性表現(xiàn),同時C-2、3雙鍵和A環(huán)OH基對黃酮的抗氧化活性也有較強的影響.而一些黃酮化合物如黃酮醇、黃酮、黃烷醇、異黃酮等,因