牛5種病毒性腹瀉病診斷和防治技術規(guī)程

牛5種病毒性腹瀉病診斷和防治技術規(guī)程范圍本標準規(guī)定了牛病毒性腹瀉黏膜病病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛紐布病毒和牛諾如病毒共5種病毒引起的牛病毒性腹瀉病臨床診斷和防治技術。本標準適用于上述5種腹瀉相關病毒的檢測，病毒性腹瀉病診斷、疫情處理、預防與控制。規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB/T18637-2018牛病毒性腹瀉粘膜病診斷技術規(guī)范GB/T19489實驗室生物安全通用要求NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運輸技術規(guī)范術語和定義下列術語和定義適用于本文件。

3.1牛病毒性腹瀉黏膜病Bovineviraldiarrhea-mucosaldisease牛病毒性腹瀉黏膜病（Bovineviraldiarrhea-mucosaldisease，BVD/MD）是由牛病毒性腹瀉病

毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）感染引起的一種病毒性傳染病。BVDV可引起牛呼吸道綜合征、繁殖障礙性疾病、腹瀉/黏膜病、免疫抑制和持續(xù)性感染等。該病呈全球性流行，在養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達國家危害尤為嚴重，造成全球乳/肉牛業(yè)嚴重的經濟損失。在我國，BVD是進口動物檢疫的二類傳染病和跨省交易運輸必檢的疫病。BVDV是單股正鏈RNA病毒，基因組約為12kb~13kb。整個基因組由三個部分組成，可分為5'端非編碼區(qū)（5'untranslatedregion，5'UTR）、開放閱讀框架區(qū)（openreadingframe，ORF）和3'端非編碼區(qū)（3'untranslatedregion，3'UTR）。

3.2牛輪狀病毒病BovineRotavirusdisease牛輪狀病毒病是由牛輪狀病毒（BovineRotavirus，BRV）引起的以嘔吐、腹瀉、脫水等為主要特征的人畜共患急性胃腸道傳染病，尤其在幼齡動物中高發(fā)。該病已在全世界主要養(yǎng)牛國家和地區(qū)普遍發(fā)生和流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴重的經濟損失。BRV為呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，無囊膜雙鏈RNA病毒，分11個基因節(jié)段，分別編碼6種結構蛋白（VPl～VP4、VP6、VP7）和6種非結構蛋白（NSPl～NSP6）。3.3牛冠狀病毒病BovineCoronavirusdisease牛冠狀病毒病是由牛冠狀病毒（BovineCoronavirus，BCoV）引起的新生犢牛腹瀉、成年牛冬季腹瀉和各年齡段牛呼吸道疾病。BCoV為不分段的單股正鏈RNA病毒，有囊膜?；蚪M全長大小介于30847bp～31100bp，具有2個開放閱讀框ORF1a和ORF1b，五種主要的結構蛋白：纖突蛋白（S）、血凝素/酯酶蛋白（HE）、核衣殼蛋白（N）、跨膜蛋白（M）和小膜蛋白（E）。3.4牛紐布病毒病Nebovirusdisease牛紐布病毒病是由紐布病毒（Nebovirus，NeV）引起犢牛腹瀉的疾病。NeV為單股正鏈RNA病毒，根據其重組酶聚合酶（RdRp）基因序列，NeV可以分為NB-like、NA1-like和DijonA216-like3種基因型；根據其完整VP1基因序列，NeV可以分為2個基因型（基因1型和基因2型），其中基因1型又細分為4個譜系（譜系1～4）。3.5牛諾如病毒病Bovinenorovirusdisease牛諾如病毒病是由牛諾如病毒（Bovinenorovirus，BNoV）引起的一種犢牛腹瀉的疾病。NoV屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，是單鏈的RNA病毒，基因組全長7.3～7.5kb。根據其基因特征，可將NoV分為6個基因型。診斷臨床癥狀感染牛主要表現為體溫升高，精神沉郁，食欲減退或廢絕；多數病牛出現不同程度的腹瀉，排出水樣稀糞，內有氣泡、粘液或血，氣味惡臭；病牛甚至迅速脫水，死亡。熒光定量RT-PCR鑒定腹瀉相關病毒4.2.1樣本采集與處理采集肛門棉拭子5~10g，置RNA保存液，-20℃及以下保存運輸不超過48h，提取并反轉錄合成cDNA。4.2.2樣本檢測依據本標準附錄A中提供的牛病毒性腹瀉粘膜病病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛紐布病毒和牛諾如病毒熒光定量RT-PCR或iiPCR方法鑒定5種主要的牛腹瀉相關病毒。防治措施隔離：發(fā)現疑似疫情，立即隔離患病動物。消毒：對病牛污染的場所、用具、物品徹底消毒。對癥治療：采取補液、強心、止瀉和防止細菌繼發(fā)感染等措施治療患病動物。補液：復方氯化鈉或生理鹽水，重癥者輸注5%葡萄糖生理鹽水或一定量的10%低分子右旋糖酐補液。強心：在補液同時選用毛花苷C、洋地黃毒苷、毒毛旋花苷K等強心劑強心。止瀉：每頭?？诜A式硝酸鉍15~30g形成一層薄膜保護腸壁止瀉。防止細菌繼發(fā)感染：單一或聯合使用喹諾酮類、氨基糖苷類、頭孢類、磺胺類或酰胺醇類抗菌藥物等1~2種防止細菌繼發(fā)感染，采用肌肉注射或靜脈注射。特異性抗體治療：高免血清或卵黃抗體對發(fā)病牛緊急治療，對受威脅牛緊急預防。疫苗緊急免疫：牛病毒性腹瀉相關病毒疫苗緊急免疫預防。無害化處理患病牛及其產品按照“農業(yè)部關于印發(fā)《病死及病害動物無害化處理技術規(guī)范》”進行無害化處理。

（規(guī)范性）

牛5種腹瀉病毒熒光PCR檢測方法及結果判定引物及探針（10μmol/L）NeV-F：5'-CAGCCCGTCTGGGTGAAT-3'；NeV-R：5'-CTGGATRGTTCTGACTTCGG-3'；BNoV-F：5'-CCTYCACGGCGAGAAGTT-3'BNoV-R：5'-CGGWGCGATGGTACAAARAT-3'BCoV-F：5'-AGTAGTGTCAGTGCTAAC-3'BCoV-R：5'-CAAGTGCCTGTAGGTATA-3'BCoV-Probe：5'-FAM-ACAACTTCCATCCCGCCAAA-TAMRA-3'BVDV1-F：5'-AAGCCTCGAGATGCCACG-3'；BVDV1-R：5'-GCAGCACCCTATCAGGCTGT-3'；BVDV1-Probe：5'-FAM-CCCACAGCACATCTTAA-MGB3'BRV-F：GCTAACCACTTGGTATCCGBRV-R：GCCATCTGAGTGATTACTCTGBRV-Probe：FAM-TACGTATTCGCTACACAGAGTAATCA-BHQ1牛5種腹瀉病毒熒光PCR檢測方法及結果判定NeV染料法real-timePCR檢測反應體系及條件反應體系：TBGreenPremixExTaqII10μL，上、下游引物各1.0μL，cDNA模板1.5μL，用DEPCH2O補齊到20μL。反應條件為：95℃1min；95℃15s、51℃30s，共40個循環(huán)；熔解段95℃15s、60℃1min、95℃，15s，1個循環(huán)，反應結束。結果判定閾值設定檢測結束后，根據收集的熒光曲線和Ct值直接讀取檢測結果，Ct值為每個反應管的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環(huán)數。閾值設定原則根據儀器噪音情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。質控標準陰性對照無Ct值，且無典型擴增曲線；或陰性對照Ct值>35.0，出現擴增曲線，但熔解曲線于88℃左右未出現明顯的峰值，熔解曲線于84℃左右未出現明顯的峰值。陽性對照Ct值<30.0，并出現典型的擴增曲線，熔解曲線于88℃左右出現明顯的峰值。否則，此次檢測結果判定為無效。結果描述及判定無Ct值，且無典型的擴增曲線；或陰性對照Ct值>35.0，出現擴增曲線，但熔解曲線于88℃左右未出現明顯的峰值，表示樣品中無病毒核酸，判定為陰性。Ct值≤35.0，出現典型的擴增曲線，熔解曲線于88℃左右出現明顯的峰值，表示樣品中存在病毒核酸，判定為陽性。30.0<Ct值<35.0，且出現擴增曲線的樣本判定為可疑。可疑樣本進行雙孔重復試驗，若任一孔或兩孔重復試驗結果為陽性者判為陽性，否則判為陰性。BNoV染料法real-timePCR檢測反應體系及條件反應體系（20μL）：TBGreenPremixExTaqII10μL，上、下游引物各1.2μL，cDNA模板1.5μL，用DEPCH2O補齊到20μL。反應條件為：95℃2min；95℃15s、57.4℃20s，共40個循環(huán)；熔解段95℃15s、60℃1min、95℃，15s，1個循環(huán)，反應結束。結果判定閾值設定檢測結束后，根據收集的熒光曲線和Ct值直接讀取檢測結果，Ct值為每個反應管的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環(huán)數。閾值設定原則根據儀器噪音情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。質控標準陰性對照無Ct值，且無典型擴增曲線；或陰性對照Ct值>35.0，出現擴增曲線，但熔解曲線于88℃左右未出現明顯的峰值，熔解曲線于84℃左右未出現明顯的峰值。陽性對照Ct值<30.0，并出現典型的擴增曲線，熔解曲線于88℃左右出現明顯的峰值。否則，此次檢測結果判定為無效。結果描述及判定無Ct值，且無典型的擴增曲線；或陰性對照Ct值>35.0，出現擴增曲線，但熔解曲線于88℃左右未出現明顯的峰值，表示樣品中無病毒核酸，判定為陰性。Ct值≤35.0，出現典型的擴增曲線，熔解曲線于88℃左右出現明顯的峰值，表示樣品中存在病毒核酸，判定為陽性。30.0<Ct值<35.0，且出現擴增曲線的樣本判定為可疑。可疑樣本進行雙孔重復試驗，若任一孔或兩孔重復試驗結果為陽性者判為陽性，否則判為陰性。BCoV探針法real-timePCR檢測反應體系及條件PCR反應體系：ProbeqPCRPremixExTaq10μL，探針0.4μL（10μmol/L），上下游引物各0.8μL（10μmol/L），cDNA模板2μL，DEPCH2O補足到20μL。反應程序為：95℃2min；95℃15s，54℃20s（采集熒光），40個循環(huán)。結果判定閾值設定閾值設定原則根據儀器噪音情況進行調整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴增的最高點為準。質量控制陰性對照：FAM通道無報告Ct值或無典型的S型擴增曲線，TAMRA通道無報告Ct值或無典型的S型擴增曲線。陽性對照：FAM通道CT值≤35，TAMRA≤35，且2個通道擴增曲線均為典型的S型。上述陰性對照和陽性對照結果要求在同一次實驗中同時滿足，否則，本次試驗無效，需重新進行。結果描述及判定被檢樣本檢測結果中FAM通道Ct值≤36，TAMRA通道≤36，且擴增曲線均為典型的S曲線，報告為BCoV核酸陽性；36<Ct值<40，判定為可疑，可疑樣品應重新檢測，如重復后仍為36<Ct值<40，且擴增曲線均為典型的S曲線，報告為BCoV核酸陽性。被檢樣本檢測結果中FAM和TAMRA通道均無CT值或無典型的S型擴增曲線，報告為BCoV核酸陰性。BVDV1型iiPCR檢測反應體系及條件反應體系：Taq酶1μL，預混Buffer25μL，引物上下游各3.5μL（10μmol?μL-1），探針0.3μL（10μmol?μL-1），反轉錄酶1.5μL（20U?μL-1），cDNA模板2μL，DEPCH2O13.2μL，共50μL。反應條件：42℃，30min，93℃，15sec，60℃，1min，40個循環(huán)。反應信號由iiPCR儀光學探測模塊自動識別，其反應結果通過系統(tǒng)默認的S/N值進行計算并被轉化為“+”（positive），“–”（negative）和“？”（inconclusive）顯示在屏幕上。結果判定質量控制陰性對照：經iiPCR反應，結果顯示為“-”。陽性對照：經iiPCR反應，結果顯示為“+”。上述陰性對照和陽性對照結果要求在同一次實驗中同時滿足，否則，本次試驗無效，需重新進行。結果判定被檢樣本檢測結果中，iiPCR儀顯示為“+”者判定為陽性；iiPCR儀顯示為“-”判定為陰性。BRViiPCR檢測反應體系及條件反應體系：Taq酶1μL，預混Buffer25μL，引物上下游各3.5μL（10μmol?μL-1）、探針0.25μL（10μmol?μL-1）、反轉錄酶1.2