花薊馬雄蟲對(duì)雄蟲氣味源的嗅覺反應(yīng)

花薊馬雄蟲對(duì)雄蟲氣味源的嗅覺反應(yīng)

花生魚刺（trybom），也被稱為臺(tái)灣花魚，屬于營馬科，屬于環(huán)馬科?；~屬于薔薇科和薊馬科，分布在中國和世界大部分地區(qū)（韓云臺(tái)洞，1997）。它是森林植物的一個(gè)重要害蟲之一。花薊馬對(duì)寄主植物的危害主要表現(xiàn)在2個(gè)方面:一是直接銼食植物的莖、葉、花、果實(shí)等器官,導(dǎo)致葉片變小、干枯;二是傳播多種番茄斑萎病毒屬Tospovirus病毒,誘發(fā)植物病毒病,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(Lewis,1997;NagataandPeters,2001)。目前,對(duì)花薊馬的防治方法主要以化學(xué)防治為主(吳青君等,2005;鐘鋒等,2009),但由于花薊馬發(fā)育歷期較短,個(gè)體小且易隱蔽于寄主植物花中,對(duì)大多數(shù)殺蟲劑易產(chǎn)生抗性,從而導(dǎo)致防治的效果并不理想。昆蟲信息素作為一種非化學(xué)控制措施,不僅可以用于害蟲種群動(dòng)態(tài)的監(jiān)測,同時(shí)也可同其他防控措施結(jié)合以提高害蟲防治效果。聚集信息素是昆蟲信息素的一種,已有研究表明,利用聚集信息素是防治薊馬的有效措施之一(KirkandHamilton,2004;Hamiltonetal.,2005)。目前有關(guān)薊馬聚集信息素成分鑒定及生物活性的相關(guān)研究國內(nèi)外仍然較少。迄今為止,只有西花薊馬F.occidentalis的聚集信息素得到有效分離和鑒定,包含有(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate2種組分(Hamiltonetal.,2005),并且已經(jīng)開發(fā)出相應(yīng)的生防產(chǎn)品。西花薊馬雄蟲產(chǎn)生的性信息素不僅有引誘異性以完成交配的功能,也有聚集兩性成蟲的功效,因此西花薊馬雄蟲產(chǎn)生的性信息素也稱為聚集信息素(Hamiltonetal.,2005)。而目前對(duì)于其他薊馬釋放的聚集信息素成分的提取鑒定目前國內(nèi)外未見報(bào)道?；ㄋE馬和西花薊馬同屬于花薊馬屬,二者形態(tài)及生物學(xué)特性均非常相似,那么花薊馬是否同西花薊馬一樣也可以釋放聚集信息素?其活性成分同西花薊馬所釋放的活性成分是否相同?對(duì)于這些問題的回答,不僅有助于更深地理解這兩種薊馬之間的關(guān)系,同時(shí)也為開發(fā)花薊馬引誘劑提供理論依據(jù)。本研究采用Y型嗅覺儀分別測定花薊馬雌雄成蟲和西花薊馬雌雄成蟲對(duì)其自身氣味源的嗅覺反應(yīng),通過固相微萃取(solid-phasemicroextraction,SPME)方法提取花薊馬雄蟲揮發(fā)物,然后利用含有不同手性柱的氣-質(zhì)聯(lián)用儀(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)對(duì)揮發(fā)物進(jìn)行組分分離和鑒定。1材料和方法1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)花薊馬于2010年采自杭州,西花薊馬于2007年采自北京,兩種薊馬分別以四季豆PhaseolusvulgarisL.飼養(yǎng)于人工氣候箱(溫度26±1℃、相對(duì)濕度75%±5%、光照周期14L∶10D)內(nèi),試驗(yàn)前花薊馬、西花薊馬已分別在室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)10代、60代。試驗(yàn)用蟲為羽化后2-5d的成蟲。1.2機(jī)器和工作條件1.2.1儀器1.2.2irasil-dexbc-質(zhì)譜條件氣相色譜工作條件:手性色譜柱BGB-176SE(30m×0.25mm×0.25μm)和手性色譜柱CP-chirasil-DexCB(25m×0.25mm×0.25μm);不分流進(jìn)樣;程序升溫:40℃,保持3min,以8℃/min升到200℃,保持5min。進(jìn)樣口溫度200℃;載氣He(>99.999%)。質(zhì)譜工作條件:離子源:EI;離子源溫度:230℃;四級(jí)桿溫度:150℃;電子能量:70eV;掃描質(zhì)量范圍35~320amu。1.2.3測試臂之間的夾角依Koschier等(2000)方法設(shè)計(jì),并略加改進(jìn),Y型嗅覺儀由玻璃制成,適應(yīng)臂長和測試臂長均為60mm,內(nèi)徑均為5mm,兩個(gè)測試臂之間的夾角為90°。此裝置以氣泵為動(dòng)力,空氣流經(jīng)活性炭、分子篩過濾后形成兩個(gè)分支,每個(gè)分支流經(jīng)一個(gè)空氣流量計(jì)(LZB-3,余姚市奇泉流量儀表有限公司)、50mL的圓底燒瓶,與Y型管的測試臂相連,各部件之間用teflon管相連。試驗(yàn)溫度:25±1℃。1.3行為選擇測試1.3.1確定中使用檢察器的制作條件及內(nèi)容利用Y型嗅覺儀測定花薊馬雄蟲釋放的揮發(fā)性物質(zhì)的生物活性。在進(jìn)行行為測試之前,利用高純二氧化碳?xì)怏w將花薊馬種群瞬間麻醉,然后用軟毛筆輕輕將雄蟲或雌蟲挑出,約50~60頭,將其轉(zhuǎn)移至50mL圓底燒瓶中,同時(shí)瓶中放一濕潤的濾紙片,作為聚集信息素氣味源。另一相同的圓底燒瓶,瓶中僅放一相同大小的濕潤的濾紙片,不放任何薊馬,作為空氣對(duì)照源。兩個(gè)圓底燒瓶的進(jìn)氣口和出氣口塞上少量的棉花,防止花薊馬成蟲從瓶中跑出,用冷光源(10000lx)對(duì)味源瓶進(jìn)行光照刺激(TerryandGardner,1990)。調(diào)節(jié)測試臂的流量為60mL/min,適應(yīng)臂的流量為120mL/min。然后取20頭花薊馬雄蟲或花薊馬雌蟲,進(jìn)行嗅覺儀試驗(yàn),測試雄蟲或雌蟲釋放的聚集信息素對(duì)不同蟲態(tài)的吸引作用。當(dāng)測試薊馬爬過某測試臂的20mm,并持續(xù)30s以上,記錄其對(duì)該氣味源作出了選擇。薊馬進(jìn)入Y型管3min內(nèi)沒有作出選擇的記為無反應(yīng)。每測試4頭薊馬將Y型管和味源瓶翻轉(zhuǎn)180°。每測完20頭薊馬用95%酒精清洗Y型管和味源瓶,120℃烘干。每組處理重復(fù)3次,記錄反應(yīng)蟲數(shù)。1.4光照刺激試驗(yàn)取30~40頭花薊馬雄蟲將其轉(zhuǎn)移(方法同1.3.1)至1.5mL玻璃瓶中,在距離玻璃瓶2cm的地方用冷光源(大約10000lx)進(jìn)行光照刺激,引起花薊馬的徘徊和打斗行為。然后利用SPME(100μm,PolydimethylsiloxaneCoating),提取雄蟲釋放的揮發(fā)性物質(zhì)5h(溫度27±1℃、相對(duì)濕度60%)(KirkandHamilton,2004)。SPME使用前在GC-MS進(jìn)樣口200℃下活化1h。每組處理重復(fù)5次。1.5外消旋體的拆分英國基爾大學(xué)(KeeleUniversity)Hamilton等(2005)已經(jīng)鑒定出西花薊馬雄蟲聚集信息素?fù)]發(fā)物的2種組分分別為(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate,本研究所需標(biāo)準(zhǔn)品(R)-lavandulylacetate(50ng/μL)和neryl(S)-2-methylbutanoate(100ng/μL)均從英國基爾大學(xué)獲得。據(jù)Hamilton等(2005)研究發(fā)現(xiàn),Beta-Dex325手性色譜柱能夠有效拆分lavandulylacetate外消旋體,CP-chirasil-DexCE手性色譜柱能夠有效拆分neryl2-methylbutanoate外消旋體。本研究采用與上述2種手性色譜柱固定相相同的2種手性色譜柱BGB-176SE(30m×0.25mm×0.25μm)及CP-chirasil-DexCB(25m×0.25mm×0.25μm)進(jìn)行花薊馬雄蟲釋放聚集信息素成分鑒定。1.5.1花薊馬雄蟲誘導(dǎo)物組r-5-4-methylbachi酒采用手性色譜柱BGB-176SE進(jìn)行花薊馬雄蟲釋放揮發(fā)性化合物及(R)-lavandulylacetate標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定;采用手性色譜柱CP-chirasil-DexCB進(jìn)行花薊馬雄蟲釋放揮發(fā)性化合物及neryl(S)-2-methylbutanoate標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定。采用的手性柱可以有效拆分消旋物,如果花薊馬雄蟲釋放的揮發(fā)性物質(zhì)中某種組分與標(biāo)準(zhǔn)品的混合物的峰完全重合,就可以確定這種組分是同標(biāo)準(zhǔn)品手性相同的同一物質(zhì)。將1μL50ng/μL的(R)-lavandulylacetate溶液或1μL100ng/μL的neryl(S)-2-methylbutanoate溶液滴至1.5mL玻璃瓶中,瓶中放一小團(tuán)脫脂棉。利用SPME吸附(R)-lavandulylacetate溶液或neryl(S)-2-methylbutanoate溶液揮發(fā)物1h,然后用GC-MS對(duì)其進(jìn)行分離和鑒定。利用SPME吸附花薊馬雄蟲揮發(fā)物(方法同1.4)3h,用GC-MS對(duì)其組分進(jìn)行分離和鑒定。首先用SPME吸附花薊馬雄蟲揮發(fā)物2h,然后利用吸附有花薊馬雄蟲揮發(fā)物的SPME吸附1μL50ng/μL(R)-lavandulylacetate溶液或1μL100ng/μL的neryl(S)-2-methylbutanoate溶液1h,用GC-MS對(duì)其組分進(jìn)行分離和鑒定。1.5.2gc-ms檢測將1μL50ng/μL的(R)-lavandulylacetate溶液和1μL100ng/μL的neryl(S)-2-methylbutanoate溶液分別注射到GC-MS中,測定其峰面積。取30~40頭花薊馬雄蟲或西花薊馬雄蟲將其轉(zhuǎn)移(方法同1.3.1)至1.5mL玻璃瓶中,在距離玻璃瓶2cm的地方用冷光源(大約10000lx)進(jìn)行光照刺激,利用SPME方法提取花薊馬雄蟲或西花薊馬雄蟲釋放的揮發(fā)性物質(zhì)5h(溫度27±1℃、相對(duì)濕度60%),每組處理重復(fù)5次。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積對(duì)花薊馬和西花薊馬雄蟲釋放的聚集信息素進(jìn)行定量,從而獲得花薊馬和西花薊馬雄蟲每頭每小時(shí)釋放的聚集信息素的量。1.6花薊馬聚集信息素的成分分析鑒定數(shù)據(jù)處理用SPSS13.0軟件進(jìn)行,嗅覺儀測定試驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方法進(jìn)行檢驗(yàn)分析?；ㄋE馬聚集信息素的成分分析鑒定,通過NIST08譜圖庫及2種標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖進(jìn)行?；ㄋE馬和西花薊馬雄蟲釋放量的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行的檢驗(yàn)分析。2結(jié)果與分析2.1行為選擇測試2.1.1花蜜馬飼料對(duì)自身味道的反應(yīng)反應(yīng)花薊馬雌蟲被花薊馬雄蟲氣味源所吸引,但不被花薊馬雌蟲氣味源所吸引;花薊馬雄蟲對(duì)花薊馬雄蟲氣味源有極顯著的選擇性(表1)。2.1.2對(duì)克氏原螯蝦的選擇花薊馬雌蟲對(duì)花薊馬雄蟲氣味源的偏好性要顯著高于西花薊馬氣味源(P<0.001),花薊馬雄蟲與花薊馬雌蟲選擇類似,對(duì)花薊馬雄蟲氣味源有顯著的選擇性(P=0.002)。西花薊馬雌蟲對(duì)西花薊馬雄蟲氣味源的偏好性顯著高于花薊馬氣味源(P<0.001),同樣西花薊馬雄蟲對(duì)西花薊馬雄性氣味源的選擇率也顯著高于花薊馬氣味源(P<0.001)(表2)。2.2花薊馬雄蟲釋放揮發(fā)性組分ab利用手性柱BGB-176SE對(duì)(R)-lavandulylacetate標(biāo)準(zhǔn)品、花薊馬雄蟲揮發(fā)物以及二者混合物進(jìn)行定性分析(圖1)。標(biāo)樣(R)-lavandulylacetate在手性柱中的出峰時(shí)間為16.31min(圖1:A);花薊馬雄蟲釋放揮發(fā)性組分a在手性柱中的出峰時(shí)間同樣為16.31min(圖1:B);并且二者的混合物在手性柱中的出峰時(shí)間仍然一致(圖1:C),由此可以確定花薊馬雄蟲釋放揮發(fā)性組分a為(R)-lavandulylacetate。圖2(A)是(R)-lavandulylacetate標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖,圖2(B)是花薊馬雄蟲釋放化合物(R)-lavandulylacetate質(zhì)譜圖。利用手性柱CP-chirasil-DexCB對(duì)neryl(S)-2-methylbutanoate標(biāo)準(zhǔn)品、花薊馬雄蟲揮發(fā)物以及二者混合物進(jìn)行定性分析(圖3)。標(biāo)樣(S)-2-methylbutanoate在手性柱中的出峰時(shí)間為20.25min(圖3:A);花薊馬雄蟲釋放揮發(fā)性組分b在手性柱中的出峰時(shí)間同樣為20.25min(圖3:B);并且二者的混合物在手性柱中的出峰時(shí)間仍然一致(圖3:C),由此可以確定花薊馬雄蟲揮發(fā)性組分b為(S)-2-methylbutanoate。圖4(A)是(S)-2-methylbutanoate標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖,圖4(B)是花薊馬雄蟲釋放化合物(S)-2-methylbutanoate質(zhì)譜圖。2.3r-larend-關(guān)于分離的植物政策由圖5可以看出2種化合物在花薊馬雄蟲和西花薊馬雄蟲中的比例是不同的。經(jīng)GC-MS定量分析發(fā)現(xiàn)花薊馬雄蟲和西花薊馬雄蟲每頭每小時(shí)釋放的(R)-lavandulylacetate的量有顯著差異(P=0.001),花薊馬的釋放量顯著高于西花薊馬;花薊馬雄蟲和西花薊馬雄蟲每頭每小時(shí)釋放的neryl(S)-2-methylbutanoate的量也有顯著差異(P=0.0045)(表3)。3討論3.1花薊馬雄蟲的聚集和釋放行為昆蟲在尋找配偶的過程中通常會(huì)由一種性別的成蟲釋放出性信息素以引誘異性前來完成交配。研究發(fā)現(xiàn),多種薊馬的雄性成蟲腹部具有分泌功能的腺體(Moundetal.,1980),該結(jié)構(gòu)的存在說明雄性薊馬有可能釋放聚集信息素(Bode,1978;SudoandTsulsumi,2002)。比如褐翅薊馬Thripsfuscipennis(Haliday)、大薊馬T.major(Uzel)(Kirk,1985)、西花薊馬(TerryandGardner,1990;MattesonandTerry,1992;TerryandDyreson,1996)、番茄薊馬F.schultzei(Milneetal.,2002)雄蟲在花上都有聚集行為。已有研究發(fā)現(xiàn),將番茄薊馬的雄性成蟲放到灰色粘蟲板上能夠顯著增加對(duì)雌性成蟲的誘捕量(Milneetal.,2002);西花薊馬雄性成蟲釋放的氣味對(duì)于其雄性個(gè)體和雌性個(gè)體均具有明顯的吸引作用(DeKogelandvanDeventer,2003;KirkandHamilton,2004)。在花薊馬成蟲對(duì)其自身作氣味源的行為選擇試驗(yàn)中,花薊馬雌蟲被花薊馬雄蟲氣味源所吸引,但不被花薊馬雌蟲氣味源所吸引,這說明花薊馬的聚集信息素是由雄蟲產(chǎn)生?；ㄋE馬雄蟲對(duì)花薊馬雄蟲氣味源有極顯著的選擇性,說明花薊馬雄蟲產(chǎn)生的聚集信息素有聚集兩性的作用。關(guān)于薊馬性信息素的研究,DeKogel和vanDeventer(2003)研究發(fā)現(xiàn)西花薊馬雄蟲氣味源對(duì)西花薊馬雌蟲有吸引作用,但是對(duì)西花薊馬雄蟲無吸引作用;Kirk和Hamilton(2004)研究發(fā)現(xiàn)西花薊馬雄蟲對(duì)西花薊馬雌蟲和雄蟲都有吸引作用;DeKogel和vanDeventer(2003)研究發(fā)現(xiàn)隨著氣味源中西花薊馬雄蟲數(shù)量的增加,可以增加對(duì)西花薊馬雌蟲的吸引。我們推測,產(chǎn)生不同試驗(yàn)結(jié)果的原因有兩個(gè)方面,一是在本研究及Kirk和Hamilton(2004)的研究中,花薊馬雄蟲和西花薊馬雄蟲氣味源用冷光源進(jìn)行光照刺激,引起薊馬的徘徊和打斗行為,薊馬的這種行為是聚集信息素產(chǎn)生的條件(TerryandGardner,1990;TerryandDyreson,1996);二是試驗(yàn)所用的雄蟲數(shù)量的不同,薊馬雄蟲數(shù)量較少時(shí),產(chǎn)生的聚集信息素濃度較低,不易被薊馬成蟲發(fā)現(xiàn),而雄蟲數(shù)量多時(shí),釋放的聚集信息素總濃度較高,易于被別的薊馬發(fā)現(xiàn),這個(gè)推論還有待進(jìn)一步證明。3.2對(duì)西花薊馬雄蟲的誘變效果Hamilton等(2005)在西花薊馬雄性個(gè)體中成功分離并鑒定出2種聚集信息素組分,分別為(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate,并確定neryl(S)-2-methylbutanoate為有效活性物質(zhì)。本研究通過2種不同的手性柱對(duì)花薊馬雄蟲釋放的揮發(fā)物進(jìn)行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)花薊馬雄蟲釋放的2種聚集信息素分別為(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate,其與西花薊馬雄蟲釋放的2種聚集信息素組分是相同的。本研究將花薊馬雄蟲與西花薊馬雄蟲釋放的2種聚集信息素進(jìn)行定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate在花薊馬和西花薊馬雄蟲中釋放的比例顯著不同。在進(jìn)一步的行為學(xué)試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)花薊馬雄蟲氣味源對(duì)花薊馬雌雄蟲具有極顯著的引誘效果,但對(duì)西花薊馬雌雄蟲沒有吸引作用;西花薊馬雄蟲氣味源對(duì)西花薊馬雌雄蟲具有極顯著的引誘效果,但對(duì)花薊馬雌雄蟲沒有吸引作用。在種類繁多的昆蟲世界中,存在生殖隔離機(jī)制,它是由生態(tài)行為、形態(tài)或生理上的原因引起的,其中包括昆蟲的性信息素,性信息素釋放時(shí)間、化學(xué)成份和成份配比的不同,造成了昆蟲的生殖隔離(石奇光和趙祖培,1986;TabataandIshikawa,2005;Pélozueloetal.,2007)。性信息素組分的差異是推進(jìn)物種特異化過程的重要因素(Linnetal.,2007)。Monti等(1995)對(duì)Spodoteralatifascia(Walker)以及S.descoinsi(Lalannecassousilvain)2個(gè)近緣種群進(jìn)行比較研究,發(fā)現(xiàn)它們雌蛾的性信息素組份是相同的,但各個(gè)種群的最佳誘芯配比不同。而性信息素活性物質(zhì)比例的不同,能夠引起不同的行為反應(yīng)。例如,梨小食心蟲Grapholitamolesta能夠辨別不同比例的性信息素組分(E)-8-dodecenylacetate和(Z)-8-dodecenylacetate,從而產(chǎn)生不同的行為反應(yīng)(LinnandRoelofs,1983)。本研究發(fā)現(xiàn)花薊馬與西花薊馬雄蟲釋放的2種聚集信息素組份相同,而定量分析表明花薊馬和西花薊馬雄蟲釋放的(R)-lavandulylacetate和neryl(S)-2-methylbutanoate2種組分的比例分別為1∶1.7和1∶12.9,聚集信息素組份比例的不同引起了不同的行為反應(yīng),使花薊馬雄蟲氣味源只對(duì)花薊馬雌雄蟲有吸引作用,西花薊馬雄蟲氣味源只對(duì)西花薊馬雌雄蟲有吸引作用,聚集信息素比例的不同可能是導(dǎo)致花薊馬和西花薊馬生殖隔離的原因之一。昆蟲同種種群之間的地理隔離有可能引起種群信息素的變異。Hansson等(1990)對(duì)歐洲保加利亞和西亞亞美尼亞的小地老虎Agrotissegetum種群雌蛾的性信息素組分進(jìn)行研究,結(jié)果表明3種主要性信息素組分Z5-10:Ac,Z7-12:Ac和Z9-14:Ac的比例分別是1∶42∶57和1∶52∶47,其配比并不相同。Huang等(1998)對(duì)日本不同區(qū)域抽樣調(diào)查亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis性信息素的地理變異發(fā)現(xiàn),南部種群與北部種群有相