食用油中氯丙醇酯的檢測(cè)方法

食用油中氯丙醇酯的檢測(cè)方法

1ags與氯丙醇酯通過加壓或化學(xué)浸泡獲得的毛油中含有大量雜質(zhì)，不適合直接食用。提取的大部分頭發(fā)油必須經(jīng)過加工和精制，才能獲得符合國家質(zhì)量和衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的食用油。精煉可以去除毛油中的水分、磷脂、色素及游離脂肪酸等雜質(zhì)組分。但隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步研究發(fā)現(xiàn),在精煉過程中會(huì)形成一些新的污染物,脂肪酸氯丙醇酯便是其中的一種。食用植物油中的氯丙醇酯主要是在精煉的脫臭工序中形成,氯丙醇酯的形成機(jī)理目前尚無統(tǒng)一的說法,但普遍認(rèn)為在Lewis酸存在條件下,食用植物油中的甘油三酯(TAGs)首先形成中間產(chǎn)物環(huán)酰氧鎓離子,環(huán)酰氧鎓離子與Cl-通過親核取代反應(yīng)可生成3-氯-1,2-丙二醇酯(3-MCPD酯),如圖1所示。環(huán)酰氧鎓離子去質(zhì)子形成縮水甘油酯,縮水甘油酯也是3-MCPD酯的前體物質(zhì)之一,由縮水甘油酯轉(zhuǎn)化形成的3-MCPD酯占其總量的10%~60%。氯丙醇酯類物質(zhì)可以看成是TAGs的1個(gè)或2個(gè)?；宦热〈纬傻幕衔?也可認(rèn)為是氯丙醇類化合物與脂肪酸的酯化產(chǎn)物。按照氯丙醇的種類的不同,氯丙醇酯分為3-氯-1,2-丙二醇酯(3-MCPD酯)、2-氯-1,3-丙二醇酯(2-MCPD酯)、1,3-二氯-2-丙醇酯(1,3-DCP酯)和2,3-二氯-1-丙醇酯(2,3-DCP酯)4大類,其中3-MCPD酯和2-MCPD酯又有單酯和雙酯之分,3-MCPD單酯根據(jù)酯基所在位置的不同又分為sn1-3-MCPD單酯和sn2-3-MCPD單酯2種。不同食用油中脂肪酸種類存在差異,因此氯丙醇酯還可呈現(xiàn)更為豐富的結(jié)構(gòu)多樣性。2006年Zelinková等首次在食用植物油中檢出3-MCPD酯并發(fā)現(xiàn)3-MCPD酯的含量遠(yuǎn)高于游離3-MCPD。Ilko等發(fā)現(xiàn)薯?xiàng)l、薯片等油炸馬鈴薯食品中3-MCPD酯主要是由吸附的煎炸油帶入,食用植物油中的氯丙醇酯污染問題開始受到人們的重視。食用植物油中氯丙醇酯污染情況調(diào)查結(jié)果顯示,食用植物油中普遍存在氯丙醇酯污染,其中最典型、污染水平最高的是3-MCPD酯。精煉植物油中3-MCPD酯含量水平為0.2~20mg/kg,其中精煉大豆油、葵花油中含量較低(0.5~1.5mg/kg),精煉棕櫚油中含量則較高(>4mg/kg)。結(jié)構(gòu)信息及人體初步消化數(shù)據(jù)表明,MCPD酯在胃腸道內(nèi)的水解行為與TAGs類似,可被胰脂酶水解釋放出游離氯丙醇,從而造成人體的氯丙醇暴露量增加。氯丙醇類化合物是公認(rèn)的食品污染物,具有腎臟毒性、生殖毒性、免疫抑制和潛在致癌性,食用油中氯丙醇酯的潛在毒性及安全性引起了很大的關(guān)注。食用植物油是人類膳食的重要組成部分,同時(shí)也是食品工業(yè)重要的基礎(chǔ)原料,其質(zhì)量安全與人體健康密切相關(guān)。對(duì)食用植物油中氯丙醇酯這一潛在危害因子的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前食用植物油中氯丙醇酯研究主要集中在以下三個(gè)方面:(1)氯丙醇酯檢測(cè)方法的建立和驗(yàn)證,以及食用植物油中氯丙醇酯含量的監(jiān)控;(2)氯丙醇酯的生物利用度及毒性評(píng)價(jià);(3)氯丙醇酯的形成機(jī)制及控制措施研究。其中,建立準(zhǔn)確可靠的分析方法是氯丙醇酯各個(gè)研究得以順利開展的先決條件。氯丙醇酯的檢測(cè)方法分為直接法和間接法兩種,直接法不破壞氯丙醇酯的分子結(jié)構(gòu),采用液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)直接檢測(cè)其含量,間接法將食用植物油中氯丙醇酯轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的氯丙醇,通過氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)測(cè)定游離氯丙醇的含量來反推計(jì)算出油樣中氯丙醇酯的含量。本文介紹了間接法和直接法,對(duì)各種檢測(cè)方法的基本原理、影響因素、儀器條件及各自的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較分析,最后展望了氯丙醇酯檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)和檢測(cè)結(jié)果的應(yīng)用。2間接法2.1間接法測(cè)定氯丙醇酯含量的一般過程間接法是在酸、堿或酶的作用下,將氯丙醇酯水解為游離的氯丙醇,以測(cè)得的氯丙醇含量來反推計(jì)算出樣品中氯丙醇酯的含量。食用植物油中氯丙醇以游離醇形式和氯丙醇酯的形式同時(shí)存在,大多數(shù)間接法直接對(duì)食用油樣品進(jìn)行水解,而不涉及氯丙醇酯和氯丙醇的分離,因而測(cè)定的結(jié)果為食用油中原有的游離氯丙醇和氯丙醇酯水解得到的氯丙醇含量之和。由于食用植物油中氯丙醇酯含量是游離氯丙醇的成百上千倍,游離氯丙醇含量相比于氯丙醇酯幾乎可忽略不計(jì),因此間接法的測(cè)定結(jié)果可近似反映食用植物油中氯丙醇酯的含量水平。向食用油體系中加入水和正己烷,通過液液萃取可實(shí)現(xiàn)氯丙醇和氯丙醇酯的分離,間接法中如在水解之前引入分離步驟,則測(cè)定結(jié)果的真實(shí)性和準(zhǔn)確性將大大提高。間接法測(cè)定氯丙醇酯含量的一般過程為:(1)向食用油體系中加入適量的內(nèi)標(biāo)物(通常為氯丙醇或氯丙醇酯的氘代物);(2)酸、堿或酶作用下氯丙醇酯轉(zhuǎn)化為游離氯丙醇;(3)中和反應(yīng)物,加入鹽析試劑提取純化游離氯丙醇;(4)氯丙醇與衍生化試劑反應(yīng)生成熱穩(wěn)定和高揮發(fā)性的衍生物;(5)GC-MS定量分析氯丙醇衍生物。2.2影響因素間接法測(cè)定結(jié)果易受操作條件的影響,每個(gè)分析步驟都可能對(duì)方法的專屬性、靈敏度、重復(fù)性、重現(xiàn)性及準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。2.2.1酸水解法mcpd間接法測(cè)定食用油中氯丙醇酯的關(guān)鍵步驟是氯丙醇酯的水解,按其水解方式的不同可分為:酸水解、堿水解和酶水解法。酸和堿水解法主要是基于酯交換反應(yīng),在酸或堿催化劑作用下,食用油中的氯丙醇酯與甲醇反應(yīng)生成游離的氯丙醇和脂肪酸甲酯,同時(shí)TAGs與甲醇反應(yīng)生成脂肪酸甲酯和甘油。脂肪酶可催化單氯丙醇酯(MCPD酯)水解為單氯丙醇(MCPD),因此酶水解法也可作為間接法,應(yīng)用于MCPD酯的測(cè)定。酸水解法常用H2SO4/CH3OH(1.8%,v:v)作為水解液,由于反應(yīng)條件溫和,因此氯丙醇酯完全轉(zhuǎn)化為游離氯丙醇需消耗較長(zhǎng)時(shí)間。酸水解法耐用性好,能夠提供更加可靠的測(cè)定結(jié)果,但反應(yīng)較耗時(shí),影響了其日常應(yīng)用。此外,如果食用油樣品中存在Cl-,當(dāng)向體系中加入酸水解液時(shí),在酸性環(huán)境下,樣品中前體物質(zhì)如縮水甘油酯會(huì)與Cl-反應(yīng)生成額外的3-MCPD,造成檢測(cè)結(jié)果偏高。為了避免Cl-對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾,通常在酸水解之前向體系中加入去離子水,除去其中的Cl-,或加入親核試劑攻擊縮水甘油酯的環(huán)氧環(huán)形成非氯丙醇酯的開環(huán)產(chǎn)物。Ermacora等建立了食用油脂中2-MCPD酯、3-MCPD酯及縮水甘油酯的酸水解測(cè)定法,在水解前向體系中加入NaBr的酸性溶液,于50℃反應(yīng)15min,酸性條件下親核試劑—Br攻擊縮水甘油酯的環(huán)氧環(huán)轉(zhuǎn)化為3-溴-1,2丙二醇酯(3-MBPD酯)。H2SO4/CH3OH作為水解液,于40℃條件下水解16h后生成2-MCPD,3-MCPD和3-MBPD,游離醇經(jīng)苯硼酸(PBA)衍生化后進(jìn)行GC-MS測(cè)定。結(jié)果表明,該方法的重復(fù)性(RSD<2.5%)、日內(nèi)重現(xiàn)性(RSD≤5%)良好,2-MCPD和3-MCPD酯的檢測(cè)限均為0.04mg/kg,縮水甘油酯檢測(cè)限為0.06mg/kg。堿水解法中常用的水解液為CH3ONa/CH3OH(0.5mol/L),作用時(shí)間短(通常只需幾分鐘),便于日常分析,因此相比于酸水解法應(yīng)用得較為廣泛。但水解產(chǎn)物3-MCPD在堿性條件下不穩(wěn)定,會(huì)進(jìn)一步降解生成縮水甘油,其原理如圖2所示。Hrncirik等研究了酸和堿水解法中水解時(shí)間對(duì)3-MCPD回收率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用堿水解法(CH3ONa/CH3OH,0.5mol/L)時(shí)添加3-MCPD棕櫚酸雙酯(PP-3-MCPD)的菜籽油原油和精煉棕櫚油水解時(shí)間為1min時(shí)的回收率分別為82.9%和95%,10min時(shí)僅為39.6%和41.4%,30min時(shí)幾乎為0;而在酸水解法(H2SO4/CH3OH,(1.8%,v:v))中水解16h未觀察到3-MCPD的降解,加標(biāo)菜籽油和精煉棕櫚油的回收率分別為100.4%和102.4%。鑒于3-MCPD在堿性條件下會(huì)降解,因此采用堿水解法時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間,以免影響方法的靈敏度。酶水解法作用條件較為溫和,但水解時(shí)間較長(zhǎng)。3-MCPD單酯和雙酯的水解特性不同,雙酯的水解速度遠(yuǎn)不及單酯,而食用植物油中氯丙醇酯主要為3-MCPD雙酯,因此,為使雙酯較完全水解需消耗較長(zhǎng)時(shí)間。此外,短鏈TAGs和Cl-在脂肪酶催化的作用也可能形成低水平的3-MPCD,從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。Chung等提出了酶水解法同時(shí)測(cè)定食用油中的2-MCPD酯,3-MCPD酯和縮水甘油酯。食用油經(jīng)正己烷提取氯丙醇酯水洗除去雜質(zhì),N2吹后,向體系中加入CandidaantarcticalipaseA及表面活性劑Triton-X100于40℃水浴16h,再向其中加入NaBr溶液,PBA作為衍生化試劑?？s水甘油酯經(jīng)脂酶水解產(chǎn)生的縮水甘油在Br存在條件下與PBA衍生化生成3-MBPD的PBA衍生物,雖然實(shí)驗(yàn)的樣品前處理簡(jiǎn)單,但由于高靈敏和高選擇GC-MS的應(yīng)用不僅背景干擾小且對(duì)2-MCPD酯、3-MCPD酯及縮水甘油酯的檢測(cè)可達(dá)到ppb的水平。2.2.2鹽析試劑的選擇除了酶水解外,食用油經(jīng)酸水解和堿水解后均需對(duì)水解液進(jìn)行中和。酸水解液經(jīng)飽和NaHCO3中和后混合溶液體系pH為7左右,只有在酸性條件下縮水甘油才可與無機(jī)氯反應(yīng)生成3-MCPD和少部分的2-MCPD,所以即使后續(xù)鹽析步驟使用NaCl作為鹽析試劑也不會(huì)有額外的3-MCPD生成,也就是說酸水解法的測(cè)定結(jié)果不受鹽析試劑類型的影響。堿水解法中常用冰乙酸溶液中和堿水解液,測(cè)定結(jié)果與鹽析試劑的種類有關(guān)。Liu等在建立堿水解法測(cè)定食用油中4種氯丙醇酯含量的實(shí)驗(yàn)中探討了鹽析試劑的類型對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所測(cè)定的茶籽油、芝麻調(diào)和油等7種油樣中,NaCl作為鹽析試劑時(shí)3-MCPD酯含量測(cè)定結(jié)果均高于Na2SO4,主要原因是堿水解液經(jīng)冰乙酸中和后的溶液呈酸性,此時(shí)若選擇NaCl作為鹽析試劑,Cl-會(huì)與前體物質(zhì)縮水甘油酯水解產(chǎn)生的縮水甘油反應(yīng)生成額外的3-MCPD,從而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。因此,為減少縮水甘油酯干擾,在本實(shí)驗(yàn)中選擇Na2SO4作為鹽析試劑。但選擇Na2SO4等其它非氯鹽析試劑也存在一些缺點(diǎn),如3-MCPD及3-MCPD-d5的提取率較低,Haines等研究在堿水解法(DGFC-III18(09)法)中分別采用Na2SO4、NaCl及NaBr作為鹽析試劑,結(jié)果表明使用Na2SO4和NaBr時(shí)3-MCPD和3-MCPD-d5衍生物的峰面積只有NaCl作為鹽析試劑時(shí)的1/10左右,方法的靈敏度大大降低。在堿水解法中,如果兼顧減少縮水甘油酯對(duì)3-MCPD酯測(cè)定的干擾和靈敏度的要求,可在堿水解前加入親核試劑攻擊縮水甘油酯的環(huán)式結(jié)構(gòu),這樣在后續(xù)反應(yīng)中即使使用NaCl作為鹽析試劑也不會(huì)形成額外的3-MCPD。DGFC-III18(09)法中先用H2SO4/1-PrOH對(duì)食用油樣品預(yù)處理,縮水甘油酯的環(huán)氧環(huán)打開,生成3-丙氧基丙烷-1,2-二醇酯(3-PPD酯),后續(xù)步驟中使用NaCl作為鹽析試劑對(duì)3-MCPD酯的測(cè)定結(jié)果無影響。Küsters等采用H2SO4/CH3OH與食用油樣品作用30min,同樣使縮水甘油酯開環(huán),但形成的開環(huán)產(chǎn)物不同,在本實(shí)驗(yàn)中生成的是3-甲氧基丙烷-1,2-二醇酯(3-MPD酯)。2.2.3衍生化試劑的選擇氯丙醇極性大、沸點(diǎn)高,一般需對(duì)其進(jìn)行衍生化生成具有良好熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性的衍生物,再進(jìn)行GC-MS分析。氯丙醇分析常用的衍生化試劑有苯硼酸(PBA)和七氟丁?；溥?HFBI),PBA只與二醇反應(yīng)形成非極性環(huán)狀產(chǎn)物,而HFBI可以與所有親核分子反應(yīng)。因此,在2-MCPD和3-MCPD測(cè)定時(shí)常選用PBA作為衍生化試劑,但若要同時(shí)測(cè)定4種氯丙醇,此時(shí)選用HFBI進(jìn)行衍生化較為合適。此外,HFBI對(duì)水分較敏感,因此在衍生化之前應(yīng)采取適當(dāng)措施如加入無水Na2SO4脫水并采用氣密針操作以減少空氣中的水分與HFBI反應(yīng)。間接法測(cè)定氯丙醇酯含量時(shí),最終產(chǎn)物氯丙醇衍生物通常采用GC-MS法進(jìn)行測(cè)定。對(duì)各種氯丙醇衍生物分離大部分是通過優(yōu)化程序升溫條件來實(shí)現(xiàn),MS中大都選用電子轟擊源(EI)進(jìn)行離子化,目前尚未有報(bào)道在氯丙醇酯的檢測(cè)中應(yīng)用化學(xué)源(CI)。2.3mcpd的分離和測(cè)定間接法研究食用油中MCPD酯總量的較多,但對(duì)MCPD單酯及雙酯含量進(jìn)行分別測(cè)定的研究則較少。由于MCPD單酯和雙酯在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物及代謝速率存在差異,因此有必要對(duì)MCPD單酯及雙酯進(jìn)行分離和分別檢測(cè)以更好地評(píng)估其安全性。傅武勝等建立了MCPD單酯與雙酯分離的方法,實(shí)驗(yàn)中采用氨基固相萃取柱,正己烷作為MCPD雙酯的洗脫溶劑,正己烷-乙酸乙酯(7:3,v:v)作為MCPD單酯的洗脫溶劑。對(duì)收集洗脫液分別濃縮,殘余物經(jīng)CH3ONa水解,PBA衍生化,GC-MS分析測(cè)定。MCPD單酯、MCPD雙酯的檢出限在83~142μg/kg(均以MCPD計(jì))之間,線性范圍為25~500μg/L(R2>0.9990)。該方法洗脫溶劑用量少,操作簡(jiǎn)單而且適合于各類食用植物油中不同脂肪酸組成的MCPD單酯和雙酯。3高效液相色譜---ms法間接法中加入酸或堿作為水解液將氯丙醇酯轉(zhuǎn)化為游離氯丙醇,但與此同時(shí),酸或堿可能會(huì)改變體系中氯丙醇的濃度。在酸水解法中,樣品中的Cl-會(huì)與前驅(qū)物反應(yīng)生成額外的3-MCPD使得3-MCPD濃度偏高;在堿水解法中3-MCPD不穩(wěn)定易降解從而影響其檢測(cè)的靈敏度。而直接法不需要對(duì)樣品水解、衍生化處理,避免了間接法前處理過程中可能引起的氯丙醇濃度的改變。此外,直接法中縮水甘油酯不會(huì)轉(zhuǎn)化為3-MCPD酯,因此對(duì)氯丙醇酯的測(cè)定不產(chǎn)生干擾。直接法多采用LC-MS測(cè)定食用油樣品中氯丙醇酯及縮水甘油酯的含量,色譜柱一般為非水反相C18柱,極性溶劑作為流動(dòng)相,根據(jù)各氯丙醇酯、縮水甘油酯與甘油三酯極性的差異采用梯度洗脫實(shí)現(xiàn)分離。MS中多采用電噴霧離子源(ESI),高分辨的飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF)作為質(zhì)量分析器。直接法中有直接稀釋后經(jīng)色譜分離質(zhì)譜檢測(cè),但大部分是先凈化后再經(jīng)色譜分離質(zhì)譜檢測(cè)。Haines等直接用含有內(nèi)標(biāo)物的稀釋液溶解油樣后,采用高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC-TOF/MS)測(cè)定食用油中MCPD酯和縮水甘油酯的含量。由于MCPD酯在常規(guī)ESI或APCI離子源下難以離子化,研究人員向流動(dòng)相中加入乙酸鈉以提高M(jìn)CPD酯離子化效率。鑒于流動(dòng)相中鈉鹽的加入,質(zhì)譜檢測(cè)的目標(biāo)物為[M+Na]+。將此法應(yīng)用于棕櫚油中MCPD酯及縮水甘油酯檢測(cè),結(jié)果顯示在棕櫚油樣品中MCPD單酯檢測(cè)限為0.16~1.69mg/kg,MCPD雙酯檢測(cè)限為0.1~1.4mg/kg,縮水甘油酯檢測(cè)限為0.09~0.29mg/kg。此法雖然前處理簡(jiǎn)單,高分辨率的TOF/MS的采用可減少基質(zhì)干擾并提高分析的靈敏度。但該法也存在一些需要解決的問題,如流動(dòng)相中Na+會(huì)損壞質(zhì)譜系統(tǒng),油樣會(huì)在儀器系統(tǒng)中殘留應(yīng)及時(shí)清洗,霧化器針易腐蝕應(yīng)定期更換等問題。雖然直接稀釋后進(jìn)樣分析比較簡(jiǎn)單,但大量共洗脫基質(zhì)組分會(huì)降低分析的靈敏度及系統(tǒng)的穩(wěn)定性。對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬艋幚?可減少基質(zhì)的干擾,提高方法的準(zhǔn)確性及精密度,因此目前大部分直接法是先凈化再經(jīng)色譜分離質(zhì)譜檢測(cè)。Hori等采用LC-TOF/MS對(duì)食用油樣品中的3種3-MCPD單酯,6種3-MCPD雙酯及5種縮水甘油酯進(jìn)行測(cè)定,樣品中加入正己烷和乙腈經(jīng)混合、離心后分為正己烷和乙腈兩相,對(duì)正己烷層和乙腈層分別進(jìn)行固相萃取(SPE)凈化,合并洗脫液經(jīng)氮吹濃縮,再經(jīng)過超高效液相色譜(UPLC)C18色譜柱系統(tǒng)以含甲酸鈉的流動(dòng)相洗脫后用TOF/MS檢測(cè),選擇離子監(jiān)測(cè)(SRM)模式下分析各化合物的鈉離子加合物。該方法的靈敏度及精確性高,保留時(shí)間RSD低于1.7%,縮水甘油酯的檢測(cè)限低于0.16ng/mL,3-MCPD單酯檢測(cè)限低于0.86ng/mL,3-MCPD雙酯檢測(cè)限低于0.22ng/mL。相比于直接稀釋進(jìn)樣,檢測(cè)的靈敏度大大提高。3-MCPD酯和縮水甘油酯的回收率為62.6%~108.8%,RSD在1.5%~11.3%。4間接法測(cè)定表面活性劑的制備Dubois等對(duì)間接法和直接法測(cè)定食用植物油中的MCPD酯進(jìn)行了比較,其中間接法采用酸水解法(H2SO4/CH3OH),直接法中首先采用固相萃取法分離食用油中的MCPD單酯和雙酯再通過LC-ESI-TOF-MS對(duì)各種MCPD酯進(jìn)行定量分析。間接法需要較少的標(biāo)準(zhǔn)品,實(shí)驗(yàn)中僅采用2種標(biāo)準(zhǔn)品(2-MCPD和3-MCPD)和1種內(nèi)標(biāo)(3-MCPD-d5),即可實(shí)現(xiàn)對(duì)食用植物油中所有2-MCPD酯和3-MCPD酯的測(cè)定。由于氯丙醇酯種類眾多且不同食用油中氯丙醇酯的分布存在差異,相比間接法,直接法需要較多的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo),在實(shí)驗(yàn)的直接法